樟疫霉效应子Avh27和Avh28基因克隆及功能研究毕业论文_林学毕业论文

樟疫霉效应子Avh27和Avh28基因克隆及功能研究毕业论文

2021-04-20更新

摘 要

樟疫霉隶属于卵菌,能引起根部腐烂和枝干溃疡等病害。樟疫霉在侵染寄主过程中可以分泌一系列RxLR类效应基因,影响植物细胞的功能和生理生化代谢,从而干扰寄主的防御反应,加快病原菌在寄主中的定殖。本研究借助农杆菌介导的PVX病毒表达系统,对樟疫霉中RxLR效应子Avh223Avh254的生物学功能进行了初步的功能分析。在本氏烟上瞬时表达这2个樟疫霉RxLR家族效应子,并验证其是否对老鼠细胞凋亡前体蛋白bax或者激发子INF1引起的植物细胞死亡具有抑制作用,或者能够激发植物的免疫反应。为进一步揭示樟疫霉的致病机制和利用病原菌效应因子提高植物抗病性提供了科学依据和参考。RxLR类效应子的鉴定与生物信息学分析对后期研究效应分子的毒性功能和作用机制提供重要依据,同时部分效应子基因功能的研究对于后期大规模筛选效应子的功能提供重要作用。

关键词:樟疫霉;Avh223Avh254基因;植物免疫;功能验证

Cloning Functional Analysis of Avh223 and Avh254 Genes From Phytophthora cinnamomi

ABSTRACT

Phytophthora cinnamomi is attached to oomycetes, which can cause root rot and stem ulcers and other diseases. Phytophthora cinnamomi in the process of infect the host can secrete a series of genes RxLR class effect, influence function and physiological and biochemical metabolism of plant cell, which interfere with the host defense responses, speed up the pathogen in the colonization of the host. In this study, the biological function of RxLR effect subs Avh223 and Avh254 was analyzed by agrobacterium mediated PVX virus expression system. In Ben’s smoke on the instantaneous expression these two camphor phytophthora RxLR family effect, and verify whether the apoptosis of mice precursor proteins bax or elicitor INF1 plant cell death is caused, or be able to stimulate the immune responses of plants. It provides scientific basis and reference for further revealing the pathogenic mechanism of scleroderma and improving the resistance of plants by using pathogenic bacteria effect factor.The analysis of the RxLR and the bioinformatics analysis is an important basis for the toxic function and function of the later study effect molecules, and it’s also a part of the study of the function of the gene function of the genes that are important to the function of the later mass screening effect.

Key words: Phytophthora cinnamomi;avh223 and avh254genes;plant immunity

transgenic tobacoo

目 录

前言 1

1 文献综述 2

1.1 樟疫霉的研究进展 2

1.1.1 樟疫霉的生物学性状 3

1.1.1 樟疫霉的危害及主要症状 3

1.2 植物与病原互作及植物免疫系统 3

1.2.1 植物与病原互作 4

1.2.2 植物免疫系统 5

1.2.2.1 PAMP-triggered immunity 6

1.2.2.2 Effector-triggered immunity 7

1.3 疫病菌的致病因子 7

1.4 卵菌RxLR效应因子的研究进展 8

1.4.1 RxLR效应因子的简介 9

1.5 樟疫霉效应分子研究展望 9

2 材料和方法 9

2.1 材料 9

2.1.1 试供烟草及供试菌株的培养 9

2.1.2 载体 10

2.1.3 实验试剂 10

2.1.4 实验仪器设备 10

2.1.5 常用培养基的配制 11

2.2 实验方法 11

2.2.1 基因组DNA的提取 11

2.2.2 樟疫霉RxLR效应子基因的克隆 12

2.2.3 大肠杆菌DH5α的质粒构建及转化 12

2.2.3.1 大肠杆菌DHα5的质粒提取: 12

2.2.4 马铃薯X病毒载体的酶切纯化: 13

2.2.5 Infusion技术构建载体 13

2.2.6 转化 14

2.2.7 转化子验证 15

2.2.8 农杆菌GV3101感受态细胞的制备和转化方法 15

2.2.8.1 农杆菌感受态细胞的制备 15

2.2.8.2 农杆菌感受态细胞的转化 15

2.2.9 效应分子筛选 16

3 结果与分析 16

3.1 樟疫霉效应子的信号肽预测 16

3.2 樟疫霉Avh223、Avh254基因属于RXLR效应蛋白家族成员 17

3.3 樟疫霉Avh223Avh254效应分子其蛋白的二级结构预测 18

3.4 效应分子基因克隆 18

3.5 载体酶切验证 19

3.6 效应分子的载体构建 19

3.7 农杆菌感受态细胞转化 19

3.8 Avh223、Avh254注射烟草细胞的观察 20

结论与讨论 23

致 谢 25

参考文献 26

附录一:樟疫霉原生质体转化系统的建立 28

1 材料 28

1.1 供试菌株 28

1.2 常用培养基的配制 28

1.3 缓冲液配制 28

1.4 酶解溶液和40%PEG溶液的配制 28

2 方法 28

2.1 樟疫霉菌株的转化培养 28

2.2 樟疫霉原生质体转化程序 28

3 结论与讨论 31

前言

樟疫霉是世界上分布最广泛的疫霉菌, 寄主范围很广, 已在68个国家的950多种寄主植物上分离得到[1]。疫霉对樟科植物会造成严重的伤害,可以存在于发病植物的根部或顶部, 也可以存在于抗病植物体内, 但不引起任何症状。对于受害植物, 樟疫霉一般首先侵染一些细根, 很快细根腐烂死亡, 开始向较大的根移动, 地上部分植物表现为叶子变黄。樟疫霉造成澳大利亚西南地区森林结构和植物种群变化,严重威胁到当地自然生态系统以及生态多样性。在中国,樟疫霉还可以危害雪松,造成雪松疫霉腐烂病。樟疫霉的普遍发生使得有效防治此病的发生成为植保工作者的主要任务。随着人们对于卵菌研究的不断深入,人们发现RxLR效应基因在植物病原卵菌与植物互作的过程中起到了重要的作用,因此,研究RxLR效应基子与寄主抗性的内在机制成为了当下研究的热点。

疫霉在侵染植物的过程中,会分泌大量的效应分子进入寄主细胞,从而发挥其毒性功能。目前在植物病原卵菌中已经发现了多种效应分子,包括分泌到植物质外体的NLP和Elicitin等家族(Apoplastic effectors)和分泌到植物细胞内的RxLR和CRN等家族(Cytoplasmic effectors)[2]。其中RxLR类效应分子是通过对卵菌无毒基因编码产物序列比较后发现的,这是一类卵菌中独特的、N端含有RxLR序列元件的效应分子。樟疫霉作为植物病原卵菌的重要一员,特别适合用来研究卵菌,同时,在樟疫霉中也存在大量的RxLR效应因子。当前对于RxLR效应因子研究最多的是致病疫霉和大豆疫霉,RxLR效应因子的功能也呈现出了多样性的特点,所以我们认为对于樟疫霉效应因子的研究十分必要且有意义。我们利用先进的分子生物学技术对樟疫霉的RxLR效应因子进行功能研究,期望能得到有意义的RxLR效应因子,未来对其进行深入研究,以期望能够为樟疫霉的防治提供理论上和实践上的依据。

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