摘 要

采用农杆菌转化法和花粉管通道法，将含目的基因GUS基因的重组质粒通过农杆菌浸染转入柳树花序中从而实现基因转变。将空质粒载体pCAMBIA1305.1与目的基因重组，采用电击法或液氮冻融转化法使重组质粒导入农杆菌内，再将培养好的带有外源DNA的农杆菌溶液涂抹在已经授粉的花柱上，或者通过花粉粒携带法使外源基因进入胚囊，从而获得具有遗传变异的植株，达到基因转化的目的。 农杆菌是一种普遍存在于土壤之中的革兰氏阴性菌，它能在自然条件下感染大多数双子叶或裸子植物的受伤部位，对其进行诱导转化。农杆菌质粒中有一段T-DNA，农杆菌成功侵染植物后这段T-DNA可以被插入到植物基因组织中，并能够通过减数分裂有效稳定的传染给子代，本实验将目的基因与空质粒载体重组并导入农杆菌中，使目的基因插入农杆菌T-DNA区，借助农杆菌的感染能力实现将外源DNA通过花粉管通道法整合进柳树花序，从而实现转基因子代的诞生。

关键词：柳树 花粉管通道法 农杆菌介导转化 转基因

The Genetic Transformation by Agrobacterium of Willow Inflorescence

ABSTRACT

Using agrobacterium-mediated reforming process and the method of pollen tube channel, will contain the purpose gene recombinant plasmid of GUS gene by agrobacterium disseminated into willow to gene transformation in the inflorescence. Will empty gene recombinant plasmid vector pCAMBIA1305.1 and purpose, the use of electric shock or liquid nitrogen freezing and thawing process causes the recombinant plasmid into agrobacterium, and then develop a good agrobacterium solution with exogenous DNA daub on already pollination styles, or through the pollen grain carry method make the exogenous gene into embryo sac, which has the genetic variation of plant, achieve the goal of gene transformation. Agrobacterium tumefaciens is a widely exists in the soil of gram-negative bacteria, it can under the condition of natural infection most dicotyledonous or injured part of the gymnosperms, to the induced transformation. Agrobacterium have a T - DNA plasmid, agrobacterium infect plants successfully after this period of T - DNA can be inserted into a plant gene in the organization, and can effectively stable transmitted to offspring through meiosis, the purpose of this experiment will gene with empty plasmid vectors in the restructuring and import the agrobacterium, make the purpose gene into agrobacterium T - DNA region, by agrobacterium infection ability will exogenous DNA through pollen tube channel to integrate into the willow flowers, so as to realize the transgenic offspring was born.

目 录

1材料与方法………………………………………………………………………………………3

1.1仪器与材料………………………………………………………………………………3

1.2方法………………………………………………………………………………………3

1.2.1簸箕柳的水培………………………………………………………………………3

1.2.2质粒的制备…………………………………………………………………………4

1.2.3农杆菌的转化………………………………………………………………………5

1.2.3.1液氮冻融发…………………………………………………………………5

1.2.3.2电击法………………………………………………………………………6

1.2.4花粉管通道法导入基因……………………………………………………………6

1.2.4.1柱头滴加法…………………………………………………………………6

1.2.4.2花粉粒携带法………………………………………………………………7

前言

外源基因导入杨树较为容易，在适当浓度的植物激素和维生素作用下，叶片、幼茎和叶柄等外植体都可以再生并整合外源基因，最后形成转基因植株。然而，由于杨树生长周期长，成熟慢，利用杨树基因工程研究杨树基因功能时受到很大程度限制。柳树和杨树同属一科，基因组结构和生长发育特征都非常相似，此外，柳树生长周期短，扦插苗当年可以开花，相比杨树是较为理想的基因功能验证材料。

柳树无性繁殖如扦插比较容易生根，但通过组织培养技术再生较为困难，通过农杆菌介导再生转化体系目前几乎没有成功例子。如何另辟蹊径转化柳树是目前柳树基因工程中的重要课题。利用花序进行基因转化的植物也有报道如利用花粉管通道方法转化大豆和棉花，但利用柳树花序转化的文献目前还没有。

本课题主要利用含有报告基因的农杆菌直接侵染柳树刚受精花序，收集种子，筛选转基因阳性植株，为研究杨树柳树基因功能提供平台。

杨树是杨属的植物，全属有约100多种，我国约62种（包括6杂交种），其中分布中国的有57种，引入栽培的约4种，此外还有很多变种、变型和引种的品系植物。

杨树是具有生长快、成材早、产量高、易于更新的特点，是世界中纬度平原地区栽培面积最大、林材产量最高的速生用材树种之一。杨树可以通过有性和无性繁殖的方式，进行育苗造林。在自然状态下，杨树的生殖特点在不同种和不同生态系统中存在差异。在平原生态系统中杨树不仅可以通过种子繁殖，还可通过枝条，树桩或树根进行无性繁殖；在丘陵地区生态系统中，杨树可以通过种子繁殖和萌芽更新来完成，杨树一般在6-10年到达成熟年龄，开始开花结实。

杨树也是苏北平原地区四大用材树种——杨、柳、榆、槐当中居于首位之树种，可见其重要性。杨树是我国的主要树种之一,杨树是杨柳科杨属。世界上有杨树100多种，单在中国就有53种之多，中国是杨树起源中心，因此，中国有杨树之乡的称号。杨树栽培具有悠久的历史，我国杨树栽培广泛，至今为止杨树木材需求量日益增大。

然而虽然杨树易生长且生长快，但对于导入外源基因用于科研的情况来说，其生长周期还是相对较长，成熟较慢的。因此选用基因组结构和生长发育特征都非常相似但生长周期短的柳树代替，进行体外基因导入。通过查阅资料可知，前期工作实验中有用农杆菌介导法和花粉管通道法将抗虫基因转入黄瓜的成功案例，优化了以子叶节为外植体的农杆菌介导转化技术，比较了切割柱头，子房注射和子房涂抹三种花粉管通道法处理授粉后的转化效果，切割柱头和子房注射均可获得带抗虫基因的黄瓜。以此作为农杆菌介导柳树花序法转基因的参照思路，如果不存在人为因素失误，也许可以成功实现柳树的转基因

柳属在世界约520种，主要产地北大洋洲无野生种。半球温带地区，寒带次之，亚热带和南半球极少，大洋洲无野生种。我国257种，各省均有分布。柳树除民用材料之外还是编织业的原料，其枝叶是野生动物的饲料，柳树皮提单宁供药用，还是水土保持、防砂、固堤、绿化的优良树种，也有些种是早春蜜源植物。

柳树的得名源自柳树的头木头作业法。木材至今仍是人们不可缺少的材料在长期使用中，人们会发现，柳树伐过枝干后，茬口处能够萌生新枝条，而且新枝通直，更利于使用。在我国乡土树种中，柳树萌枝能力最突出。因此便形成了对柳树的头木作业，在一定高度截去树冠，促进新枝萌生，每隔几年伐取枝条利用。头木作业的结果是保留树干，以便持续利用枝条。这就柳树得名的所在。“柳”字与“留”字读音相同，“柳树”就是“留树”，表示保留树干以便再次利用的一类树。柳树耐寒、耐涝、耐旱易成活易繁殖，栽培方法简单生命力强，因此是替代杨树作为本次实验的不二之选

花粉管通道技术是周光宇先生在20世纪80年代建立的，其基本原理是DNA片段杂交，由于该技术克服了常规育种技术中存在的远缘杂交不亲和现象，因而在利用远缘种质拓展栽培作物遗传基础方面具有重要作用。其过程是在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。花粉管通道法最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握

农杆菌是一种天然的基因转化系统。根瘤农杆菌中含有肿瘤诱导质粒（Ti），其上含有可转移DNA（T-DNA）区、毒性区（Vir区）以及冠瘿代谢基因编码区。T-DNA两端是两个25bp的重复序列，分别称为左边界和右边界，两个边界序列之间是生长素和细胞分裂素合成基因以及冠瘿碱合成基因。Vir区中含有多个基因段，每个基因段都含有多个基因。当植物受到伤害时，分泌含有酚类化合物的汁液，这些酚类化合物一方面通过染色体毒性基因介导的催化作用促使农杆菌向植物受伤部位移动并附着于植物细胞表面；另一方面则被Ti质粒上由VieA和VirG组成的爽组分调节系统识别，从而诱导其他Vir基因的表达。VirD1和VirD2结合，其余部分与VirE2结合，组成T-复合体。T-复合体被转移到农杆菌外，通过植物细胞壁上VirB蛋白组成的通道进入到植物细胞内。Vird2和VirE2上的核定位信号被转运蛋白识别，经主动运输过程通过核孔进入细胞核内，在VirD的帮助下，插入植物核染色体中，完成T-DNA由农杆菌向植物的转移及整合过程