摘 要

北美鹅掌楸于20世纪30年代引入我国。引种栽培试验结果表明，北美鹅掌楸生长快，观赏性好，但在干旱、水涝、盐碱等逆境中生长不良。脱水素（DHN）基因与植物的抗逆性（抗旱、耐盐碱）有关，开展北美鹅掌楸脱水素基因LtDHN的克隆与功能分析可为北美鹅掌楸适应性功能基因的开发及提高鹅掌楸适应性提供参考。

本研究运用RT-PCR 和RACE技术在北美鹅掌楸EST片段的基础上获得其全长序列。利用DNAMAN软件将456bp的3'RACE和390 bp的5'RACE PCR扩增结果进行拼接获得全长为741bp的LtDHN。利用在线软件ORF Finder进行开放阅读框（ORF）的预测,该基因包括 1 个74bp 的 5’-UTR，1个142bp的3’-UTR，以及长为525bp的开放阅读框（ORF）。通过与NCBI数据库比对，对该脱水素基因进行同源序列比对，并与其他物种中的同源蛋白质构建系统进化树。研究结果表明：该LtDHN分子式是C₇₄₆H₁₁₉₂N₂₅₂O₂₅₇S₃，分子量为17899.3KDa，理论等电点PI为8.93，总平均亲水性-1.364，亲水性较强。二级结构中含较多无规则卷曲结构(56.90%)，有少量α-螺旋(19.54%)和β-折叠(8.62%)。三级结构预测北美鹅掌楸脱水素LtDHN编码的蛋白质是以 3voo.1.A为模板建立的，两者相似性为13%。

关键词： 北美鹅掌楸；LtDHN；RACE；基因克隆；生物信息学分析

Cloning and bioinformatics analysis of Dehydrin gene in Liriodendron tulipifera

Abstract

Liriodendron tulipifera was introduced into China in 1930s. The introduction and cultivation test showed that L.tulipifera grows fast and is an excellent ornamental tree, nevertheless, it grows not well in adverse enviroments such as drought, water logging and salinization. The DHN gene is thought to be associated with plant resistance (drought resistance and salt tolerance), therefore, cloning of LtDHN gene from L.tulipifera and predicting its function may be helpful in future breeding application of L.tulipifera.

In this study, RT-PCR and RACE technology were used to obtain the full-length sequences of DHN gene from L.tulipifera. DNAMAN software was used to splice the result. 456bp 3'RACE and 390 5'RACE splice out a 741bp full length of LtDHN. Using online software ORF Finder to predict the ORF. The gene includes 74bp 5'-UTR, 142bp 3' –UTR and a 525bp ORF. By comparing with NCBI database, homology sequence was found and alignment. A phylogenetic tree of this gene was constructed.The main results are as follows: the molecular formula of LtDHN is 746H1192N252O257S3. The predicted Molecular weight is 17899.3KDa, and the theoretical isoelectric point is 8.93. The grand average of hydropathicity is 0.33, so it has strong hydrophilic. LtDHN protein’s secondary structure has random coil (56.90%), a little α-helix (19.54%) and extended strand (8.62%). Tertiary structure prediction of LtDHN protein was established according to the 3voo.1.with a 13% similarity.

Keywords: L.tulipifera; LtDHN; RACE; gene cloning; bioinformatics analysis

目 录

1 文献综述 1

1.1北美鹅掌楸概况 1

1.2脱水素研究现状 2

1.2.1脱水素结构 2

1.2.2脱水素的性质 2

1.2.3脱水素功能 3

1.2.4脱水素分布 3

1.2.5脱水素的作用机制 3

1.3．研究的目的和意义 4

2 材料与方法 5

2.1实验材料 5

2.1.1植物材料 5

2.1.2实验试剂 5

2.1.3仪器设备 5

2.2实验方法 5

2.2.1 北美鹅掌楸总RNA的提取与纯化 5

2.2.2 北美鹅掌楸脱水素基因部分序列的克隆 6

2.2.3 北美鹅掌楸脱水素基因RACE扩增 8

2.2.4 凝胶回收与纯化 15

2.2.5 目的基因的克隆 15

2.3.6序列及生物信息学分析 15

3 结果与分析 17

3.1 LtDHN基因的克隆 17

3.2 LtDHN基因的序列分析 18

3.2.1北美鹅掌楸脱水素LtDHN基因的同源序列比对 18

3.2.2 北美鹅掌楸脱水素LtDHN基因进化树的构建及分析 20

3.2.3北美鹅掌楸脱水素LtDHN基因的保守序列分析 20

3.3 LtDHN基因的编码蛋白质结构预测 20

3.3.1 北美鹅掌楸LtDHN基因编码的蛋白质一级结构及基本性质分析 20

3.3.2北美鹅掌楸脱水素LtDHN基因编码的蛋白质的二级结构预测 22

3.3.3 北美鹅掌楸脱水素LtDHN基因编码的蛋白质的三级结构的预测 24

4 结论与讨论 26

4.1 结论 26

4.2 讨论 26

致谢 28

参考文献 29

1 文献综述

1.1北美鹅掌楸概况

北美鹅掌楸(Liriodendron tulipifera L.)，落叶大乔木，高可达60m，胸径3.5m；小枝为褐色或紫褐色。叶片马褂状，长7-12cm，宽与长相等，每边有1-2,少为3-4片短而渐尖的裂片，幼叶下面密生白色细毛，后渐脱落，老叶下面无毛和白粉；叶柄长3-7.5cm。花单生于枝顶端，郁金香状；花被片外面的卵状披针形，灰绿色，张开而易落，内面的椭圆状倒卵形，长4-5cm，灰绿色，近基部有橙黄色的宽边；雄蕊多数；心皮多数，先端较前种尖锐。聚合果纺锤形，长6-8cm，具翅的小坚果先端尖或突尖。

北美鹅掌楸自然分布于美国的东部和加拿大的东南部,而主要集中在阿巴拉契亚山南部,与同属的鹅掌楸(L.chinense (Hemsl.) sarg)成为东亚与北美洲间断分布的两个种^[1]。北美鹅掌楸干型高大、生长快速,是优质的胶合板、高档家具和造纸的理想用材。北美鹅掌楸最早于20世纪30年代被引入中国,栽培于南京、青岛、昆明、上海、杭州等地。我国著名林木育种学家叶培忠教授等人在1963年开展了北美鹅掌楸和马褂木的种间杂交,最后获得的杂种表现出了强大的杂种优势。