摘 要

鸟苷酸及其代谢衍生物是胞内核酸合成的底物，也是重要的信号分子。在原核生物、低等真核生物和节枝动物中，GKs非常保守，突变致死。为了研究该激酶的特点，尤其在真核细胞中表达更好地接近其天然蛋白结构，本研究论文主要是构建真核表达载体，具体步骤为：用TRIZOL试剂提取拟南芥突变体的总RNA，反转录形成cDNA，RT-PCR扩增目的基因片段，对pPICZaA::mcAtGK1表达载体进行酶切鉴定，最终构建真核表达载体。

关键词：真核生物；鸟甘酸激酶；载体构建

The Construction of Guanosine Monophosphate Kinase AtGK1 Eukaryotic Expression Vector

ABSTRACT

Guanylic acid and its derivatives are the substrate of intracellular nucleic acid synthesis metabolism. And this is also a important signal molecules. In prokaryotes, low eukaryotes and section branch animals, GKs is very conservative and easy to go death. In order to study the characteristics of the kinase, especially expressed in eukaryotic cells and be much closer to its natural protein structure, this paper is mainly to construct eukaryotic expression vector, and the concrete steps as follows: extracting total RNA of arabidopsis mutants with TRIZOL reagent, forming cDNA with Reverse transcription, amplifying target gene with Rt-pcr, enzyme identifying the expression vector of pPICZaA: : McAtGK1 and constructing eukaryotic expression vector finally.

Key words：Eukaryotes; Guanylate kinase; Carrier to build

目 录

1 前言 - 5 -

1.1植物卷叶表型 - 5 -

1.2 长柄果实的观赏性 - 5 -

1.3 拟南芥模式植物与园林植物 - 5 -

1.4 鸟苷酸激酶突变植株的表型 - 5 -

1.5 鸟苷酸激酶生化特征和研究方法 - 6 -

2 实验材料和器材 - 7 -

2.1 实验材料 - 7 -

2.2 实验器材 - 7 -

3 实验步骤 - 2 -

3.1 突变型拟南芥总RNA提取 - 2 -

3.1.1 实验原理 - 2 -

3.1.2 实验方法 - 2 -

3.2 反转录 - 2 -

3.3 PCR扩增 - 3 -

3.4 TA克隆和测序 - 3 -

3.5 构建真核表达载体 - 3 -

3.6 利用IPTG来诱导蛋白表达 - 4 -

3.6.1 原理 - 4 -

3.6.2 操作步骤 - 4 -

4 实验结果分析 - 5 -

4.1总RNA提取 - 5 -

4.2 AtGK1编码区序列克隆 - 5 -

4.3 RT-PCR - 6 -

4.4 表达载体构建 - 6 -

4.4.1 表达载体构建的方法 - 7 -

4.4.2 pPICZaA::mcAtGK1表达载体酶切验证 - 8 -

讨 论 - 9 -

致 谢 - 10 -

参考文献 - 11 -

1 前言

1.1植物卷叶表型

日常生活中，各种各样的植物在我们身边随处可见，它们具有各种各样的形态以及与众不同的作用。而其中植物叶的可塑性很大，它是植物形态构造最容易发生改变的器官而其中植物的卷叶表型更是被被广泛应用于园艺等领域，用来美化我们的生活环境。

1.2 长柄果实的观赏性

观果植物的观赏性主要具有观花、品果、赏叶、看型、闻香等5打优势，而其中长柄果实与其他普通果实相比，显然更加显得与众不同，容易引起人们的好奇心以及满足人们对新奇事物的追求，因此也会被人们用来作为观赏性植物。

1.3 拟南芥模式植物与园林植物

拟南芥 （Arabidopsis thaliana）又名鼠耳芥，阿拉伯芥，阿拉伯草，十字花科植株，被子植物门，双子叶植物纲^【3】。其基因组大约为12500万碱基对和5对染色体。二年生草本，我国内蒙、新疆、陕西、甘肃、西藏、山东、江苏、安徽、湖北、四川、云南等省区均有发现。拟南芥的优点是植株小、结子多。拟南芥的基因组是目前已知植物基因组中最小的。拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。

由于有上述这些优点，所以拟南芥是进行遗传学研究的好材料，被科学家誉为“植物中的果蝇”。正因为其植株小，生长周期短且产量大，很容易通过人工诱变产生遗传变异得到大量诱变体，而这些诱变体往往符合成为园林植物的要求，因此可以说拟南芥模式植物为园林植物种类的不断增添和更新提供了源源不断的原材料和动力。

1.4 鸟苷酸激酶突变植株的表型

当前关于鸟苷酸激酶突变植株的研究的热潮一点没有降低的趋势，本课题前期工作中发现模式植物拟南芥中因为鸟苷酸激酶发生突变，植物叶子由原先的平滑变成了卷叶表型，果实也由原来的模样变成了长柄果实。

1.5 鸟苷酸激酶生化特征和研究方法

鸟苷酸及其代谢衍生物是胞内核酸合成的底物，也是重要的信号分子。在原核生物、低等真核生物和节枝动物中，GKs非常保守，突变致死。关于GKs在高等生物中的功能目前还知之甚少。本课题前期工作中发现模式植物拟南芥中一个GK基因突变后，植株胚珠发育异常，导致植株雌性不育。

为了更进一步了解该基因的功能，挖掘该激酶特征，本课题以拟南芥突变体为起始材料，通过进行一系列实验，最终通过比较该突变型与野生型目的基因的酶活来解析鸟苷酸激酶是如何对植株的表型进行影响以及这种影响有何积极意义和应用。酶活测定的方法一般分为取样测定法和连续测定法两种。

2 实验材料和器材

2.1 实验材料

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