苦楝SSR引物筛选与遗传多样性研究毕业论文_林学毕业论文

苦楝SSR引物筛选与遗传多样性研究毕业论文

2021-04-20更新

摘 要

苦楝(Melia azedarach L)又被叫做楝树是楝科的落叶乔木,广泛分布于亚洲和非洲。本研究主要围绕苦楝的遗传多样性和地理变异的规律的问题展开,收集了来自江苏南京,山东菏泽,云南昆明和湖南长沙这四个省市的16份苦楝资源,我们建立和优化苦楝的ISSR-PCR反应体系并对苦楝的遗传多样性进行整理和分析。利用筛选出的6对多态性高,重复性高的引物对16份来自不同省份的苦楝资源进行遗传多样性分析。结果表明:6对引物在16个样品中的平均等位基因(Na)数为3.33,有效等位基因数(Ne)平均值为1.96,观察杂合度(Ho)平均值为0.32, Shannon 多样性指数(I)平均值为0.26,平均期望杂合度(He)为0.37,

说明苦楝具有较高的遗传多样性。基于聚类分析的结果16份苦楝样品被分为五个类群,表明苦楝的遗传多样性与地理分布位置有一定关系。本研究为优秀苦楝核心种质资源的种育的改进和早期选择提供了科学依据,具有重要的理论价值和现实意义。

关键词:苦楝;SSR标记;遗传多样性;遗传结构

The genetic diversity of Melia azedarach based on the SSR molecular marker

Abastract

Melia azedarach L is a deciduous tree of the family Polygonaceae, widely distributed in Asia and Africa. This study focuses on the genetic diversity of bitterness and the laws of geographical variation. It has collected 16 bitter resources from Nanjing, Shandong Heze, Yunnan Kunming and Hunan Changsha. We have established and optimized the bitter SSR-PCR reaction system and organization and analysis of the genetic diversity of tartary buckwheat. Six pairs of highly polymorphic and highly reproducible primers were used to analyze the genetic diversity of 16 bitter resources from different provinces. The results showed that the average number of alleles (Na) of the six pairs of primers was 3.33, the average number of effective alleles (Ne) was 1.96, and the average degree of heterozygosity (Ho) was 0.32. Shannon diversity The index (I) average is 0.26 and the average expected heterozygosity (He) is 0.37. It indicates that bitter buckwheat has high genetic diversity. Based on the results of cluster analysis, 16 bitter samples were divided into five groups, indicating that the genetic diversity of bitter buckwheat has a certain relationship with the geographical distribution. This study provides a scientific basis for the improvement and early selection of the elite germplasm resources, and has important theoretical and practical significance.

Key words:Melia azedarach L;SSR molecular markers;Genetic diversity

目录

1 引言 1

1.1 植物DNA分子标记研究进展 1

1.2 SSR分子标记在林木上的应用 2

1.3 苦楝遗传多样性研究进展 4

1.4 研究目的与意义 5

2 材料与方法 6

2.1 实验材料 6

2.2主要引物 7

2.3 实验方法 9

2.3.1 苦楝DNA提取 9

2.3.2 PCR扩增 9

2.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 10

2.4 数据分析 11

3 结果与分析 12

3.1 苦楝叶片DNA提取结果 12

3.2 SSR引物筛选及SSR扩增多态性条带统计 13

3.3 遗传多样性分析结果 14

3.4聚类分析结果 16

4 总结与讨论 19

5 感谢 22

参考文献 23

引言

苦楝(Melia azedarach L)是楝科的落叶乔木,在全球大约有51属,大多集中分布在亚洲和非洲。根据文献记载在我国的西南部和东部盛产川楝和苦楝[1]。这种树由于对土壤要求不严,在酸性土壤,碱性土壤中都可生存,在湿润肥沃的土壤中更是长势良好,所以是平原丘陵地区优良的行道树树种。它树体高大,可达20米,小枝粗壮且有明显的叶痕和皮孔。叶互生,一至三回奇数羽状复叶,小叶有叶柄,叶边缘全缘或有锯齿。花淡紫色,有香味呈现圆锥状,由多个二歧聚伞花序组成,花两性,花萼5-6深裂,排列成覆瓦状;5-6片白色或紫色的花瓣螺旋排列;圆筒状雄蕊管,口部扩展,花药着生于雄蕊管上部的裂齿间,环状花盘;子房近球形有3-6室,每室有叠生的胚珠2颗。黄色果实近球形,外种皮硬壳质,胚乳肉质,薄或无,约含4枚种子。苦楝也是一种天然的生物农药,它的树皮,根皮含有苦楝素,还有其他苦味成分具有和山道年类似杀虫作用的化合物。它能够驱虫,影响呼吸中枢,影响神经元传递,延长动作电位的时程,还对肉毒中毒动物具有治疗作用[2]。由于现在的合成农药会对环境造成污染,并且还会使其目标族群产生抗药性,以及农药对于非目标的族群也会有一定的负面影响,因此对苦楝的研究具有重大的意义。

1.1 植物DNA分子标记研究进展

DNA分子标记是由Grodzicker等人提出的,该技术是为了反映DNA水平上遗传变异的现代遗传标记[3]。DNA分子标记具有以下等特点,例如:多态性较高,标记数量多,易于鉴别纯合基因型和杂合基因型且不受发育状况、环境变化的影响等,因此被广泛应用于植物遗传研究中[4][5]。随着DNA分子标记技术的发展,一些分子标记技术逐渐被我们所熟知例如:SCoT、SNP(单核苷酸多态性)、AFLP(单核苷酸多态性)、InDel(插入缺失标记)和SSR(简单重复序列)等。SCoT 分子标记是 Collard 等开发的新型分子标记,其原理是根据植物基因中起始密码子(ATG)侧翼保守性序列,设计单引物,扩增与性状相关的目的基因。它具有成本低廉、操作简便、多态信息高,遗传稳定性好,引物通用性强等特点。经过多年的发展在植物种质鉴定和指纹图谱构建、种质资源遗传多样性和亲缘关系分析、基因差异表达和分子图谱构建等方面均取得了阶段性的进展[4]。SNP(单核苷酸多态性)分子标记是由Lander在1996年正式提出的第三代分子标记即单核苷酸多态性。其原理是相同或不同物种的个体DNA 序列同一位置上存在单核苷酸差异的现象。单个碱基的插入、缺失、转换和颠倒均可以造成这种差异。一个变异位点需要其中一个等位基因在群体中的频率大于1%才能被定义为SNP位点[6]。由于SNP在基因组织中分布相当的多,所以有助于人们发现各种疾病和病变。它在人类致病基因筛选、致病风险诊断及预测、个体化药物筛选等生物、医学研究领域、生物遗传连锁图谱构建等方面得到广泛的应用。AFLP(单核苷酸多态性)分子标记是由Keygene等人发明的分子标记技术。AFLP是RFLP(限制性内切酶片段长度多态性)和RAPD(随机扩增多态性DNA标记)的完美结合,它的原理是利用两种不同限制性内切酶对DNA进行切割,形成不同长短的DNA片段,利用人工合成的接头连接,形成可以结合引物的位点,通过PCR扩增放大差异,最后利用电泳获取DNA分子间的多态信息[7]。由于它具有重复性强,可靠性好,可信度高等优点,因此在甲基化研究、种质资源鉴定和分析遗传多样性、分类和进化研究,基因表达与调控等方面广泛应用。InDel(插入缺失标记)标记是同一位点的DNA分子序列在不同的个体间发生了核苷酸序列的插入或缺失,本质上属于长度多态性标记。InDel标记因为具有稳定性好、分型系统简单、多态性高等特点[8]。 开始应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种以及人类医学诊断、法医遗传学等领域。SSR(简单重复序列)即简单重复序列分子标记技术,又被叫做微卫星标记技术[9],是穆尔在1991年发明的,这是根据真核生物具有一系列高度串联重复的序列[10]。DNA复制时的滑动造成重复序列的重复次数的差异,导致SSR位点长度的不同。SSR标记具有以下几个特点:(1)它能够区分杂合子和纯合子;(2)在不同的遗传材料中,等位基因变异特别多,所以SSR位点变异的树木非常大,具有较高的多态性;(3)广泛分布在随机的基因组中,数量丰富,并且还存在于外显子和内含子中;(4)操作方便简单而且成本较低,并且因为其稳定性和重复性比较好,所以它得到的结果比较可靠;(5)SSR引物通用性较高。所以SSR技术已经成为了植物遗传问题研究的重要的分子标记方法之一。目前该技术已经广泛应用于遗传多样性分析、遗传图谱的构建、目的基因的标定等方面[11]

1.2 SSR分子标记在林木上的应用

目前很多有关植物遗传问题的研究都使用到了SSR分子标记技术。我国南方沿海夏季台风频繁,风害严重影响沿海地区的生态安全以及相关产业的发展,尤其对林木生长构成极大威胁,成为制约桉树人工林可持续发展的重要因素之一,因此选育优良的抗风系植物成为了一项重要任务。赤桉(Eucalyptus camaldulensis)是一种耐旱、耐瘠、抗风、抗病能力极强的树种,尚秀华通过对114个赤桉家系(半同胞)为材料对其生长、材性、物理力学、化学成分等26个性状进行跟踪调查,对各个性状进行遗传变异分析并通过相关性分析寻找影响桉树抗风的主要影响因素。研究在获得影响桉树抗风的主要影响因素的基础上利用SSR分子标记技术进行关联分析,对桉树抗风相关性状进行关联分析,系统剖析赤桉抗风的遗传基础,发掘优良SSR位点。得出了以下结论遗传多样性分析参试材料为8个赤桉群体的109株样品,参试标记为覆盖全基因组的107个SSR位点。55个中性的基因组SSRs揭示了赤桉群体多样性水平较高,共检测到1116个等位片段,平均每位点20.3个等位片段,PIC为0.3508~0.9489,平均0.771,位点均为多态性较高的位点,HE平均值为0.718,说明赤桉发生高度杂合,Fst平均值为0.066,群体间的遗传分化不显著,分子方差分析中群体间方差分量仅占1%,说明遗传变异主要存在于群体内。从赤桉Nei(1972)遗传距离分析发现澳大利亚亚群遗传背景差异较大。赤桉群体具有丰富的遗传多样性,可进行抗风品系选育和遗传改良的基因库[12]。我国的森林覆盖率在世界排名中较低,现代树木的遗传改良,改善现代树木遗传杂合度高、生命周期长且经济性状多为数量性状的现状成为重中之重。宋志姣以巨桉(Eucalyptus grandis)和细叶桉(E.tereticornis)天然群体子代苗建立的大田试验林为材料,基于全基因组低密度的简单序列重复(Simple sequence repeat,SSR)标记,检测了巨桉和细叶桉适应性和抗枝瘿姬小蜂(Leptocybe invasa)关联的基因组位点,通过转录组分析,发现了一批与枝瘿姬小蜂抗性相关的候选基因[13]。火力楠是一种常绿大乔木,是南方重要的乡土珍贵用材和多功能高效益树种。但目前对该树种的种质资源遗传多样性研究匮乏,导致良种缺乏,因此李清莹利用15个数量性状4个质量性状,并借助近红外光谱技术、转录组测序技术以及EST-SSR分子标记等,从表型、生理生化和分子水平等对火力楠种质资源遗传多样性进行系统性研究,多方面揭示了火力楠种质资源遗传多样性的特点,分析了参试种源/家系关键性状的群体遗传变异规律,为火力楠优良材料的选择、遗传改良和育种计划的制定提供理论基础,利于促进其在热带及亚热带地区的推广应用[14]。落叶松是我国北方主要造林及用材树种,在建筑材、纸浆材等方面发挥重要作用,因此对落叶松的研究极为重要。贯春雨选择黑龙江省牡丹江市林口县青山林场的日本落叶松(Larix kaempefri)×兴安落叶松(L.gmelinii)及其145个F1个体作为测绘组,同时,利用RAPD (随机扩增多态性DNA标记)和SSR 构建日本落叶松(Larix kaempefri)×兴安落叶松(L.gmelinii)的遗传连锁图谱,并首次结合生长性状(树高、胸径、冠幅和材积),木本性状(木材密度、管胞长度、管胞宽度和管胞长宽比)进行QTLs定位分析,为落叶松分子标记辅助育种提供理论依据[15]

1.3 苦楝遗传多样性研究进展

苦楝作为一种生物农药的重要原材料它的种质资源在我国仍处于散生或未改良的状态,受自然选择和地理环境因素的影响遗传变异幅度较大,形成了不同地理生态类型,有着极其丰富的遗传基础,因此对苦楝这一树种的遗传信息的研究有着很大的发展空间。目前国内也很多对苦楝表型遗传变异研究[16]王芳等人采用单因素法和正交试验设计进行SSR-PCR反应体系优化,并利用该体系以8个不同种源的苦楝基因组DNA为模板,从135对候选SSR引物中进行引物筛选出15对适用于苦楝的SSR引物,成功优化了苦楝ISSR-PCR反应体系[17]。廖柏勇关于苦楝种源地理变异规律和遗传多样性分布的研究,开展了对苦楝各种生长性状的地理变异规律研究,分析了种源间和种源内生长性状遗传变异,并基于遗传距离和遗传结构分析结果,使种源和种源谱系之间的性状差异达到了显著水平。以遗传距离和遗传结构分析结果为基础,结合果核、种子表型地理变异和幼林种源生长适应性分析,建议将中国苦楝分布区初步划分为3个种源区[18]。程诗明用7对AFLP引物分析了8组240个个体基因组的分层随机抽样。通过扩增得到658条清晰谱带,其中650条为多态性谱带,各群体多态位点百分率为51.4%-76.29%[19]。陈羡德利用筛选出的20个SSR引物对不同来源15个的苦楝进行分析,用20个随机引物共扩增出193条重复性好、清晰的谱带,其中有189条多态性谱带,占97.9%[20]。夏海涛采用筛选出24个简单重复序列问多态性SSR引物对来自13个种源的苦楝样本进行DNA分析,共扩增出382个位点,多态位点百分率为98.43%,其中南宁和仓山种源的多态位点百分率最高,为54.97%,延平的多态位点百分率为为43.98%,最低,表明13个种源苦楝的遗传多样性丰富[21]。SSR分子标记可以很好地反映苦楝的遗传多样性,聚类类群划分结果有明显的地理趋势和气候生态特征。

1.4 研究目的与意义

目前我国对苦楝的研究还处于初始阶段,对和苦楝素含量有关的遗传基因研究,更是少之又少。对于苦楝优良树种的培育,还存在着很大问题。本次研究是通过运用SSR分子标记技术,对来自全国各地的苦楝样本进行引物设计,并进行扩增,找出它们之间的共同点和差别,并进行分类整理。对优良苦楝树种共同的拥有的基因进行研究,优化苦楝树种的培育过程,有效减少相似遗传背景的组合。为指导苦楝优良树种的培育提供了数据和理论上的支持,并且对我国苦楝的种质资源的分布进行了整理和归纳。

2 材料与方法

2.1 实验材料

选择苦楝资源分布较为丰富的省份作为群居代表采样点(表1),为保证实验的准确性每株植物采取10—20 g的叶片,叶片就地封存于自封袋中,放入冰盒并带回实验室,用液氮处理后存放于-70°C超低温冰箱中备用,用于DNA提取。

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