摘 要

喜树（Camptotheca acuminata）又名旱莲、水桐树，属于蓝果树科喜树属，为多年生落叶阔叶树乔木，是中国特有的树种，分布范围广泛，它目前多用作叶用林、木材林和景观林等大面积种植。本研究围绕喜树遗传多样性分布和种源地理变异规律等问题，采集了江苏、浙江、江西、四川、安徽、湖北6省8个喜树种质资源，以优化和建立喜树ISSR-PCR反应体系，并进行了喜树遗传多样性分析。采用ISSR分子标记技术，评价不同地域的8份喜树种质资源的遗传多样性。喜树遗传多样性水平分析表明，平均有效等位基因数（Ne）为1.47042，Nei基因多样性（He）为0.28933，平均Shannon信息指数（I）为0.45，它的种群遗传多样性相对丰富。聚类分析显示，喜树的遗传多样性与其地理分布位置具有一定的相关性。本研究为优异喜树核心种质资源的早期选择和育种的改进提供了科学依据，具有重要的理论价值和现实意义。

关键词：喜树；ISSR分子标记；ISSR-PCR反应体系；遗传多样性

Study on the genetic diversity of Campotheca acuminate based on the ISSR molecular markers

ABSTRACT

Campotheca acuminata, was famous for its specific accumulation of camprothecin , belonged to the C Nyssaceae. It was a perennial deciduous macrophanerophytes . It was also one of the endemic tree species and widely distributed in China. At present, it was wildlyused as a large area of plantation for leaf forest, timber forest and landscape forest. This study focused on the genetic diversity and the geographical variation of Campotheca acuminata n, and we collected eight germplasm under the nature condition from Jiangsu, Zhejiang, Jiangxi, Sichuan, Anhui and Hunan provinces to explore the genetic diversity based on ISSR molecular markers. Firstly, we optimized and established the ISSR-PCR reaction system for Campotheca acuminata. And then, we analysed the genetic diversity analysis of Campotheca acuminata based on the high polymorphism ISSR marker. With the help of eight pairs of ISSR molecular marker, the genetic diversity of eight different geographical distribution germplasm resources was evaluated. The genetic diversity of Campotheca acuminata was that the average effective allele number(Ne) was 1.47042, the Nei genetic diversity (He) was 0.28933, the average Shannon information index (I) was 0.4500, and nearly all the Campotheca acuminate could be distinguished. The UPGMA cluster analysis showed that the genetic diversity of Campotheca acuminata had a certain correlation with its geographical distribution. This study layed a foundation for the early selection of outstanding Campotheca acuminate core germplasm resources, which had important theoretical values and practical significances in Campotheca acuminate breeding.

Key words: Campotheca acuminata; ISSR molecular markers; ISSR-PCR; Genetic diversity

目 录

1 引言 1

1.1 本文研究内容 3

1.2 喜树的研究现状 3

1.3 本文研究的目的及意义 4

2 材料与方法 6

2.1 实验材料 6

2.2 实验仪器 6

2.3 实验方法 6

2.3.1 喜树叶片总DNA的提取 6

2.3.2 ISSR引物的筛选 7

2.3.3 ISSR-PCR反应体系 7

2.3.4 ISSR-PCR扩增产物电泳检测 7

2.3.5 数据处理与统计分析方法 8

3 结果与分析 9

3.1 喜树叶片DNA提取结果 9

3.2 ISSR引物筛选及ISSR扩增多态性条带统计 10

3.3 遗传多样性分析结果 11

3.4 聚类分析结果 11

4 总结与讨论 13

5 展望 17

致 谢 18

参考文献 19

1. 引言

喜树（Camptotheca acuminata）亦称旱莲、水桐树，属于蓝果树科喜树属，它是一种多年生落叶阔叶树乔木。喜树是中国特有的一种落叶乔木，生长速度快，品种丰硕。20世纪60年代，在中国是一种优良的街道树和遮荫树，喜树的树姿美丽，树干挺直，高大雄壮，生长速度快，根深、发芽率高。喜树高20-25m，叶长卵形，全缘微波状，叶鲜绿色，幼叶紫红色。喜树喜潮湿和阳光，不耐寒。生长温度13℃-17℃，冬季温度为零下5℃，土壤适宜肥沃、潮湿、疏松、酸性和中碱性砂质壤土^[1]。目前，它们大部分作为大面积的叶用林、用材林和景观林种植栽培。我国喜树散布规模很广，最北至陕西省秦岭地域，最南至云南省西双版纳地域。主要散布在江苏、浙江地域和长江以北的部分地域。我国喜树资源丰富，其中，四川省喜树资源最多，约占全国喜树资源总量的一半，其次是广东和广西^[2]。喜树属是中国特有属，英文版《中国植物志》提到该属有两个种和一个变种，分布于中国。其中，除了广泛分布于我国南方地区的原始品种外，广东西北部还有另外一种薄叶喜树的变种。这个变种与原变种之间的区别主要在于薄叶树的叶片较原变种更薄，果实比原变种的更为细长，侧脉少，他们通常位于低海拔河流和森林边缘，这些标本收集于广东怀集。除喜树外，还有一种喜树物种是洛氏喜树，主要分布在湖南，福建，广西，广东，四川和江西等地。喜树与洛氏喜树的形态不同主要表现在喜树叶片为窄椭圆形形或长椭圆形，侧脉11-15对；洛氏喜树的叶片形状为椭圆形或心形，侧脉的数量比喜树少6-8对^[3]。此外，对喜树的人工栽培也缺乏系统的研究，在种苗、造林方法等方面，一些书籍中有部分记载。喜树一般在11月左右成熟，萌芽率有70％。一亩播5千克种子，育苗4万株左右。喜树生长速度较快，4年左右可为林，10年后生长逐渐停止，20年后生长基本停滞。叶子生长占比上升到8月，9月开始下降；茎生物质在9月份占最大比例^[4]。喜树被国务院核准为首批国家重点保护野生植物。喜树全株含有抗癌生物碱，喜树的根、树皮、叶、枝干、果实均可以作为药物使用，喜树主要的衍生物类化合物是天然植物来源最重要的抗癌药物。由于喜树碱类抗癌药物产量的增添，需求的喜树碱及其制备的原料将明显增多，所以开发喜树碱及其系列衍生物产品，对种植喜树或育苗有良好的发展前景。喜树挺直，早春新叶为嫩红色，夏季为鲜绿色，叶茂荫强；喜树果实美丽，具有观赏价值，可作为遮荫树和街道树。喜树可以防止二氧化硫，能改良和绿化环境。喜树木材呈浅黄褐色，结构精细均匀，木材合成纤维素含量高，材质轻巧柔软，易干燥、不易开裂，木纹美丽，漆画后具有光泽，它是造纸的重要原料，也被普遍用作建筑、小家具、雕塑、包装等材料。植物源农药作为一种新型的环保农药，具有快速分解、低残留、低污染、低毒性的特点^[5]。

近年来，分子标记技术在生物学范畴得到了普遍的运用。与分子标记技术有两点观点，在广义上，它指的是一种蛋白质或DNA序列，它可以被遗传，也可以被检测到；在狭义上，指的是特定DNA的片段，能够显示出群体及个别生物间基因组的某些差别。常见分子标记技术类型有SSR、SRAP、RAPD、AFLP和ISSR。这类技术之所以受到青睐，这是因为分子标记可以直接以DNA的形式表达，在生物体结构和发育的各个阶段都可以检测到，不受环境限制；分子标记数量极大，遍布整个基因组，而且检测基因座的数量没有限制；它的多态性很高，在自然界中有许多等位基因，不需要人工创造；它不干扰目的性状的表达，特点是“中性”，许多标记具有共显性，可以区分纯性状和杂合性状^[6]。