稻曲病菌致病相关基因UvCPKA的敲除毕业论文_林学毕业论文

稻曲病菌致病相关基因UvCPKA的敲除毕业论文

2021-04-20更新

摘 要

由稻曲病菌引起的水稻稻曲病是我国水稻生产的重要穗部病害,严重威胁水稻质量和安全。稻曲病的发生概率的提高是因为逐渐增高的气温,杂交水稻的大规模栽种以及施肥水平的提高,人们对该病害越来越重视。作为活体寄生病原真菌,目前对稻曲病菌的致病机制知之甚少。

生物体能感受并传导内外环境刺激,能够在发育过程中调控基因表达以及生理生化,这一现象被称为细胞信号传导。蛋白激酶A(Cpka)作为cAMP-PKA信号途径的主要元件,可能在稻曲病菌的生长发育和侵染过程中发挥重要作用。本研究结合crispr方法和同源重组原理,进行了稻曲病菌UvCPKA的crispr载体和基因敲除载体的构建,采用PEG介导的原生质体转化方法,将crispr载体和基因敲除载体共同转化至稻曲病菌野生型菌株,从23个转化子中初步筛选出5个UvCPKA基因缺失突变体,该研究结果为后续的致病相关基因UvCPKA的功能研究提供基础。

关键词:稻曲病菌;UvCPKA;致病相关基因;基因敲除

Knock out of UvCPKA of Ustilaginoidea virens

ABSTRACT

Rice false smut, caused by Ustilaginoidea virens, is an destructive panicle disease in China, which seriously threatens the quality of rice production. The frequent occurrences of rice false smut was due to the warming of climate, the large-scale planting of hybrid rice, and the increasing fertilization level. This disease has risen from the secondary disease of rice to the main disease. As living parasite pathogenic fungi, little is known about the pathogenic mechanism of Ustilaginoidea virens.

Cellular signal transduction is the process of organisms sensing and conducting internal and external environmental stimuli, regulating gene expression and physiological and biochemical reactions during growth and development. Protein kinase A (Cpka), a major component of cAMP-PKA signaling pathway, may play an important role in the growth and development of rice false smut. In this study, we make use of CRISPR method and homologous recombination principle. First, we constructed the CRISPR vector and knockout vector of gene UvCPKA. Then the PEG mediated protoplast transformation method was used to convert the CRISPR vector and the gene knockout vector into the Ustilaginoidea virens wild strain, five UvCPKA gene deletion mutants were initially screened from 23 transformants. The results can provide raw materials for subsequent study of the pathogenic related gene UvCPKA.

Key words:Ustilaginoidea virensUvCPKA;pathogenicity related genes;gene knockout

目 录

1 文献综述………………………………………………………………………………………1

1.1 水稻稻曲病的概述………………………………………………………………………1

1.1.1稻曲病的发生和危害………………………………………………………………………1

1.1.2 稻曲病流行的原因…………………………………………………………………………2

1.1.3 稻曲病的发生症状……………………………………………………………………2

1.1.4 稻曲病菌的生物学特性……………………………………………………………………2

1.1.5 稻曲病菌的毒素……………………………………………………………………3

1.2基因功能研究方法……………………………………………………………………3

1.3基因的分析方式…………………………………………………………………………3

2 材料与方法………………………………………………………………………………4

2.1 试验菌株及培养条件…………………………………………………………………………4

2.1.1 稻曲病菌株及培养条件……………………………………………………………………4

2.1.2 细菌菌株及培养条件………………………………………………………………………4

2.2 UvCPKA-sgRNA质粒载体的构建……………………………………………………………………4

2.2.1 sgRNA序列筛选及引物设计………………………………………………………………4

2.2.2 合成sgRNA短片段…………………………………………………………………………5

2.2.3 pMCas9-sgRNA质粒提取…………………………………………………………………5

2.2.4 pMCas9-sgRNA质粒酶切……………………………………………………………………6

2.2.5 sgRNA短片段与酶切后的pMCas9-sgRNA质粒连接与转化………………………………6

2.2.6 挑菌检测……………………………………………………………………………………6

2.3 UvCPKA基因敲除载体的构建…………………………………………………………………6

2.3.1上下游片段及潮霉素片段扩增及回收…………………………………………………7

2.3.2 敲除载体获得………………………………………………………………………………8

2.4稻曲病菌原生质体转化……………………………………………………………………………8

2.5稻曲病菌UvCPKA突变体的检测…………………………………………………………………9

3 结果与分析…………………………………………………………………………………………10

3.1 UvCPKA-sgRNA载体的构建…………………………………………………………………… 10

3.1.1 sgRNA靶点序列筛选及引物设计………………………………………………………10

3.1.2 UvCPKA-sgRNA载体构建………………………………………………………………10

3.2 UvCPKA基因敲除载体的构建………………………………………………………………10

3.2.1 上下游片段及潮霉素片段扩增………………………………………………………10

3.2.2 敲除载体获得…………………………………………………………………………11

3.3稻曲病菌原生质体转化及转化子筛选…………………………………………………………11

结论…………………………………………………………………………………………………13

致谢…………………………………………………………………………………………………14

参考文献……………………………………………………………………………………………15

  1. 文献综述

水稻稻曲病是一种水稻穗期的真菌病,由半知菌亚门绿核菌属的绿核菌导致,又被叫做伪黑穗病、黑球病。在农业方面,人们非常重视该病害。二十世纪80年代以来,由于各方面的原因,稻曲病的发生越来越严重,包括高产杂交水稻的推广以及在分蘖期和孕穗期用氮肥,该病发生频繁且范围广导致了产量的大幅减少 [1]。病害产生的主要原因是菌源足够、气候条件适合、品种抗性弱、田间管理失当以及农人防治知识浅薄等;治理的方法包括选用抗病性强的品种、加强栽培期间的管理、让农人认识到防治的重要性、减少初侵染来源以及进行化学防治[2]

1.1水稻稻曲病的概述

在我国大部分区域种植且有高产量的农作物都是水稻,且水稻的谷子在中国有60%以上的人口是当主食来吃的[3]。该病不止会造成水稻的产量减少,健康的稻谷还会被它带有毒素的孢子污染,降低稻米的质量,严重影响了水稻的健康生产[4]

1.1.1稻曲病的发生和危害

水稻稻曲病首次是印度在1878年发现,亚洲、欧洲、非洲等40多个国家均有发现[5]。在1899年,有学者将稻曲病被命名为Ustilaginoidea virens (Cooke) P.Henn[6]。上世纪80年代之后,稻曲病在中国的发生越来越频繁,在辽宁、黑龙江、湖南、云南、广东等省及江浙一带疫情普遍发生,连年来一直是较大范围的发生。三分之一的种植土地都有发生,损失了总量的5%-10%,有的农田甚至损失过半,因此相关部门十分的重视该病 [7]。这几年来,日本、印度、美国以及东南亚其它地区也都有稻曲病的出现或加剧的报道[8-10]

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