摘 要

枯草芽孢杆菌Bs916是一株广谱生防菌，其对水稻的多种病害都有较好防效，其中对水稻纹枯病的防治效果最好。芽孢杆菌产生的脂肽类物质是其发挥防效的主要因素。本研究利用酸沉淀法提取Bs916菌株发酵液中的脂肽类抗生素，并进行脂肽抗生素粗提液的排油活性和对水稻纹枯病菌（Rhizoctoniasolani）的抑菌效果分析，筛选出影响抑菌效果的发酵培养基主成分（葡萄糖、蛋白胨、NaCl、MnSO₄、L-亮氨酸、MgSO₄）；通过Plackett-Burman试验设计、中心组合试验设计（CCD），优化了Bs916菌株高产脂肽类抗生素的发酵培养基成分。确定了Bs916菌株产脂肽类抗生素的最佳培养基为：葡萄糖10.03g/L，蛋白胨2.5g /L ，NaCl 3.3g/L，MgSO₄ 0.1g/L，MnSO₄ 0.15g/L，L-亮氨酸 1.86g/L。菌株Bs916利用优化后发酵培养基发酵所产生的脂肽类抗生素对纹枯病菌的抑菌带最宽，达14.2±0.15 mm，与理论预测值无显著差异。本研究为Bs916菌株更高效的生防制剂开发提供技术支撑。

关键词： Bs916；脂肽类抗生素；中心组合试验；发酵培养基

Optimization of Fermentation Process of Bacillus subtilis for Production of Lipopeptide antibiotics in Flask

ABSTRACT

Bs916 showed strong biocontrol activities to Rice sheath blight. Here, the fermentation process was optimized to improve the yield of lipopeptide antibiotics, which will provide technical support for the development of biocontrol agent contained Bs916.According the inhibition zoom of Lipopeptide extraction against Rhizoctoniasolani, the main nutritional components that are suitable for the production of lipopetides in Bacillus subtilisBs916 were screened by comparing the effects of 9 media that are commonly used for cycle lipopetide antibiotics production by Bacillus. After that, the Plackett-Burman method, the central composite design were used to obtain optional medium. The optimum medium of Bs916 was Glucose10.03g/L, Peptone 2.5g /L, NaCl3.3g/L，MgSO₄ 0.1 g/L，MnSO₄0.15g/L，L-Leucine 1.86g/L. Under the optimum fermentation medium and culture conditions, the width of inhibition zoom was about 14.0046±0.15 mm. Fermentation experiments with shake flasks verified that there was no statistical difference between real and forecasted yields.Response surface methodology was used in the optimization of the fermentation of Bs916 for production of Lipopeptide, which was proved to be effective.

Keyword: Bs916; Lipopeptide antibiotics; The central Composite design；Fermentation medium

目 录

1.文献综述 - 1 -

1.1芽抱杆菌在植物病害防治中的应用和主要作用机制 - 1 -

1.1.1芽抱杆菌在植物病害防治中的应用 - 1 -

1.1.2芽抱杆菌在植物病害防治中主要作用机制 - 1 -

1.2芽孢杆菌酯肽类抗生素的研究概况 - 2 -

1.2.1研究概况综述 - 2 -

1.2.2生防芽孢杆菌脂肽抗生素的种类及特性 - 3 -

1.2.3脂肽的生产方法及分离纯化 - 3 -

1.3脂肽抗生素的发展潜力及应用 - 3 -

1.3.1发展潜力 - 3 -

1.3.2应用领域 - 4 -

2 材料与方法 - 6 -

2.1试验材料 - 6 -

2.1.1 供试菌株 - 6 -

2.1.2 培养基配方 - 6 -

2.1.3 试验相关试剂、仪器等 - 6 -

2.2 发酵种子液的制备 - 7 -

2.3 脂肽类抗生素的提取 - 7 -

2.4 发酵液菌含量的测定 - 7 -

2.5 排油活性的测定 - 7 -

2.6 抑菌活性的测定 - 7 -

2.7 培养基成分的筛选 - 8 -

2.7.1 培养基初步成分筛选 - 8 -

2.7.2 培养基基本成分复筛 - 8 -

2.7.3筛选不同离子对Bs916产生脂肽类物质的影响 - 8 -

2.7.4筛选不同氨基酸对Bs916产生脂肽类物质的影响 - 8 -

2.8 培养基组分关键因子筛选 - 9 -

2.8.1 Plackett-Burman试验设计 - 9 -

2.8.2 最陡爬坡试验设计 - 9 -

2.9中心组合试验（CCD） - 9 -

2.10 数据分析 - 9 -

3 结果与分析 - 10 -

3.1 Bs916发酵最佳培养基组成成分筛选 - 10 -

3.1.1 基础培养基初筛 - 10 -

3.1.2 基础培养基复筛 - 10 -

3.1.3 培养基中加入不同离子再次筛选 - 11 -

3.1.4 培养基中加入不同种氨基酸再次筛选 - 12 -

3.2 Plackett-Burman筛选培养基关键因素 - 14 -

3.3 培养基关键因子的爬坡试验 - 15 -

3.4 培养基关键因素中心组合设计试验 - 15 -

4 结论 - 16 -

致谢 - 18 -

1.文献综述

1.1芽抱杆菌在植物病害防治中的应用和主要作用机制

1.1.1芽抱杆菌在植物病害防治中的应用

芽孢杆菌属于革兰氏阳性细菌中的一科，多数是在一个菌体内只形成一个位于菌体内的芽孢。应对外界有害因子其具有分布广泛，抵抗能力强，分裂繁殖速度快，对营养条件要求简卑的优点。研究表明，芽孢杆菌的生防效果与其在根表面（Rhizoplane）的定殖能力和其所产生的多种抗菌物质或蛋白质酶类等密切相关。其在植物的表面或内部芽孢杆菌容易定植，是在植物表面、根部和土壤有重要作用的微生物种群。基于芽孢杆菌能够适应高温、电磁福射、紫外线、极酸和某些化学药品等不利条件，而且芽孢杆菌的外分泌液中含有多种蛋白酶、淀粉酶、脂酶等酶类及其他活性代谢产物，因此，这类细菌能以芽孢的形态广泛存在于各类自然环境中，可以生存在一些极端恶劣的环境中，且能分解利用环境中一些其他微生物难以分解的矿物质^[12]。与非芽孢细菌相比，芽孢杆菌在农业生产中的应用，在防病的稳定性、与化学农药的相容性等方面具有明显的优势。另外，芽孢杆菌容易加工成可湿性粉剂，能够方便储藏和运输，对实现大规模工业化生产有利，应用前景光明。

1.1.2芽抱杆菌在植物病害防治中主要作用机制

（1）进行营养和空间的竞争

微生物之间的竞争主要体现在争夺生存空间和营养物质。主要表现在对生态位点、物理位点、营养物质以及空气等的竞争。一方面，在人工导入的情况下，生防拮抗菌可以提前占领自己可以定殖的植物部位，因此能优先占据有利于自己的物理位点以及生物学位点，对病原菌的侵染产生物理阻挡或生态排斥效应，使病菌无法接近侵染位点，起到防止寄主被病原微生物侵染的作用。另外，拮抗菌还能够通过竞争同一位点的营养来限制病原菌繁殖的数量。

（2）拮抗作用

拮抗作用是指生防菌株可以分泌一些次生代谢产物到细胞外，这些合成代谢产物可以制约病原微生物的繁殖或者能够直接杀死病原微生物，或是用这些代谢产物调节周围的微环境，使其对病原微生物的生长和繁殖不利。拮抗作用是生防芽孢杆菌抑制病原微生物最主要的作用机制，常被作为重要指标来进行生防菌株的初步筛选。

（3）溶菌作用

溶菌作用是指拮抗微生物吸附在病原真菌的菌丝上，并随着菌丝生长而生长，然后产生溶菌物质来消解菌丝体，能够使菌丝发生断裂、解体、细胞质消解，或者是产生次生代谢产物溶解病原菌孢子的细胞壁，导致发生细胞壁穿孔、畸形。

（4）诱导植物产生抗病性

芽孢杆菌除了可以直接抑制植物病原菌的生长与繁殖之外，还能够诱导植物产生抗病性，可以通过诱发植物自身的抗病潜能从而达到增强植物抗病性的目的。

1.2芽孢杆菌酯肽类抗生素的研究概况

1.2.1研究概况综述

生防微生物防治植物病害的相关研究可追溯至上世纪20年代，根围拮抗芽孢杆菌因其抑菌谱广、对多种植物病害具较好防效，促生效果明显而被广泛深入研究。

抗生素是由微生物( 包括细菌、真菌、放线菌属) 或高等动植物在生命活动过程中产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物，能干扰其他细胞的正常功能。大量使用抗生素的隐患渐渐被大众了解，而脂肽抗生素因为杀菌活性高和抗药性低被人们广泛关注深入研究。

脂肽类抗生素是芽孢杆菌发挥生防作用的重要因子。已有生防机理研究表明，芽孢杆菌非核糖体合成途径产生的脂肽类抗生素，具有直接杀死或抑制病原物生长、与病原菌进行营养和空间的竞争和诱导植物产生抗病性的作用。脂肽类抗生素不仅具有拮抗作用，而且可以影响生防菌生物膜的形成从而影响其在根部定殖的能力。