脂肽类抗生素的分离纯化及表面活性素对生物膜形成的影响毕业论文_林学毕业论文

脂肽类抗生素的分离纯化及表面活性素对生物膜形成的影响毕业论文

2021-04-20更新

摘 要

化学农药是防治植物病害的主要方法,但长期不合理的使用带来了一系列问题,如对土壤、大气和水体造成了严重污染,打破了生态平衡,产生了农药抗性等。国内外已经开始使用生防措施防治植物病害,其中芽孢杆菌是重要的生防资源,开发潜力大,应用前景广。本试验通过酸沉淀法提取芽孢杆菌Bs916在LB中发酵产生的脂肽类抗生素,运用NH2柱、C18柱吸附法和梯度洗脱方式进一步分离、纯化,NH2柱过柱结果表明,0.5%的甲酸甲醇洗脱液中含有的脂肽类抗生素排油活性最大; C18柱过柱结果显示,70%的甲醇洗脱液中含有的脂肽类抗生素排油活性最大,质谱检测表明其唯一的脂肽类抗生素成分是表面活性素。用分离获得的70%的甲醇洗脱液(8.3mg Surfactin/mL)进行表面活性素对细菌生物膜形成的影响试验,结果表明,表面活性素对不同菌株的生物膜形成有不同的影响,对枯草芽孢杆菌Bs916、解淀粉芽孢杆菌 FZB42、枯草芽孢杆菌OKB105和Bs168来说,少量的表面活性素对生物膜形成有促进作用,多量的表面活性素对生物膜形成有抑制作用;对于枯草芽孢杆菌PTS-394主要是抑制生物膜的形成;而对于萎缩芽孢杆菌HLE434,表面活性素则促进其生物膜的形成。

关键词:芽孢杆菌;表面活性素;分离纯化;生物膜

Separation and Purification of Lipopeptide Antibiotics and Effect of Surfactin on Biofilm Formation

ABSTRACT

Chemical pesticides are the main means of controlling plant diseaes and pests, but

long-term unreasonable use has brought a series of problems,such as serious pollution to the soil,atmosphere and water,breaking the ecological balance, and producing pestici-de resistance.At home and abroad, biological control measures have been used to pre-vent and control plant diseases. Among them,Bacillus is an important biocontrol resou-rce, with great development potential and wide application prospects.In this experiment,lipopeptide antibiotics produced by fermentation of Bs916 in LB were extracted by ac-idprecipitation method. NH2 column, C18 column adsorption and gradient elution wereused to further separate and purify Surfactin.In the NH2 column elution, the activity of lipopeptide antibiotics contained in the 0.5% formic acid methanol solution was fo-und to be the highest. In the C18 column elution,the activity of Surfactin contained inthe 70% methanol solution was found to be the highest.Mass spectrometry showed th-at the 70% methanol solution contained the most homogeneous components and conta-ined mainly Surfactin.The isolated 70% methanol eluate (8.3 mg Surfactin/mL) was u-sed to test its effect on bacterial biofilm formation. The results showed that Surfactin had different effects on the biofilm formation of different strains.A small amount of Surfactin has a promoting effect on the formation of Bs916,FZB42,OKB105 and Bs168 biofilm. A large amount of Surfactin has an inhibitory effect on the formation of PTS-394 biofilm. For HLE434, it mainly promotes the formation of biofilm.

Key words:Bacillus;Surfactin;Separation and purification;Biofilm

目 录

前 言 1

1 文献综述 3

1.1生防芽孢杆菌的研究现状 3

1.2脂肽类抗生素的分离纯化方法研究进展 3

1.3表面活性素及其应用 4

1.3.1在食品工业中的应用 4

1.3.2在医疗中的应用 4

1.3.3在农业中的应用 4

1.3.4在洗涤用品和化妆品工业中的应用 5

1.3.5在石油工业中的应用 5

1.3.6在环境保护方面中的应用 5

2 材料与方法 6

2.1 试验材料 6

2.1.1 菌株 6

2.1.2 培养基配方 6

2.1.3 试验相关试剂、仪器 6

2.2 脂肽类抗生素的分离、纯化 7

2.2.1 脂肽类抗生素粗提物的制备 7

2.2.2 脂肽类抗生素的分离 7

2.2.3脂肽类抗生素的纯化 8

2.3 脂肽类物质的质谱检测 8

2.4表面活性素对芽孢杆菌生物膜形成的影响 8

3 结果与分析 10

3.1 Bs916在LB中产表面活性素的最佳发酵时间 10

3.2 脂肽类抗生素的分离和纯化 10

3.2.1 含有目标化合物最多溶液的初步确定 10

3.2.2目标化合物的进一步纯化 11

3.3 甲醇洗脱液分离纯化脂肽类物质的主成分质谱分析 12

3.4 表面活性素(Surfactin)对生物膜形成的影响 12

结 论 14

致 谢 15

参考文献 16

前 言

几十年来,我国过量施用化肥、农药等化学物使土壤微生物区系受到很大破坏,在农田土壤上表现为:土壤养分的生物转化能力越来越弱,农作物对化肥供给养分的依赖越来越强;在经济作物土壤上表现为:土传病害越来越严重,田地利用率低下,影响了我国农业的可持续发展。随着作物种植年限的不断増加,土壤养分失衡、次生盐渍化和酸化等问题也都逐渐出现,严重危害生态环境。近几年来,植物根际促生菌在农业领域中得到越来越多的关注,不仅因为它能促进植物生长、防控土传病,而且因为它还具有环境友好和安全无毒的特点[1]

植物根际促生菌是一类定殖于植物根际,具有促进植物生长能力的细菌的总称[2]。根据它定殖于根际的位置,可分为两大类:一类是胞内植物根际促生菌,通常只局限地定殖于植物某些特殊组织或细胞内,形成根瘤,相关报道最早可追溯到19世纪80年代,Beijerinck从植物根瘤中分离出第一株根际细菌[3];另一类是胞外植物根际促生菌,定殖于根系细胞外,不形成根瘤,但能通过产生信号物质直接促进植物生长,加速土壤元素循环和提高植物抗性,相关研究主要集中于芽孢杆菌属、假单胞菌属和欧文氏菌属[4]

自然界中,微生物可以产生一系列的生物表面活性剂,其通常是一类复合的酯类物质,目前按照结构划分可分为6大类,比如脂肽、糖脂或磷脂等。现研究最多的是脂肽类抗生素,主要由芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属的细菌产生[5],含有由亲水性氨基酸和疏水性脂肪酸链组成的特殊分子结构,表现出亲水和亲脂的两亲性,具有抗菌和抗病毒等多种生物学活性,在农业、医学等领域具有良好的应用潜力[6]

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