摘 要

化学农药是防治植物病害的主要方法，但长期不合理的使用带来了一系列问题，如对土壤、大气和水体造成了严重污染，打破了生态平衡，产生了农药抗性等。国内外已经开始使用生防措施防治植物病害，其中芽孢杆菌是重要的生防资源，开发潜力大，应用前景广。本试验通过酸沉淀法提取芽孢杆菌Bs916在LB中发酵产生的脂肽类抗生素，运用NH2柱、C18柱吸附法和梯度洗脱方式进一步分离、纯化，NH2柱过柱结果表明，0.5%的甲酸甲醇洗脱液中含有的脂肽类抗生素排油活性最大； C18柱过柱结果显示，70%的甲醇洗脱液中含有的脂肽类抗生素排油活性最大，质谱检测表明其唯一的脂肽类抗生素成分是表面活性素。用分离获得的70%的甲醇洗脱液（8.3mg Surfactin/mL）进行表面活性素对细菌生物膜形成的影响试验，结果表明，表面活性素对不同菌株的生物膜形成有不同的影响，对枯草芽孢杆菌Bs916、解淀粉芽孢杆菌 FZB42、枯草芽孢杆菌OKB105和Bs168来说，少量的表面活性素对生物膜形成有促进作用，多量的表面活性素对生物膜形成有抑制作用；对于枯草芽孢杆菌PTS-394主要是抑制生物膜的形成；而对于萎缩芽孢杆菌HLE434，表面活性素则促进其生物膜的形成。

关键词：芽孢杆菌；表面活性素；分离纯化；生物膜

Separation and Purification of Lipopeptide Antibiotics and Effect of Surfactin on Biofilm Formation

ABSTRACT

Chemical pesticides are the main means of controlling plant diseaes and pests, but

long-term unreasonable use has brought a series of problems,such as serious pollution to the soil,atmosphere and water,breaking the ecological balance, and producing pestici-de resistance.At home and abroad, biological control measures have been used to pre-vent and control plant diseases. Among them,Bacillus is an important biocontrol resou-rce, with great development potential and wide application prospects.In this experiment,lipopeptide antibiotics produced by fermentation of Bs916 in LB were extracted by ac-idprecipitation method. NH2 column, C18 column adsorption and gradient elution wereused to further separate and purify Surfactin.In the NH2 column elution, the activity of lipopeptide antibiotics contained in the 0.5% formic acid methanol solution was fo-und to be the highest. In the C18 column elution,the activity of Surfactin contained inthe 70% methanol solution was found to be the highest.Mass spectrometry showed th-at the 70% methanol solution contained the most homogeneous components and conta-ined mainly Surfactin.The isolated 70% methanol eluate (8.3 mg Surfactin/mL) was u-sed to test its effect on bacterial biofilm formation. The results showed that Surfactin had different effects on the biofilm formation of different strains.A small amount of Surfactin has a promoting effect on the formation of Bs916,FZB42,OKB105 and Bs168 biofilm. A large amount of Surfactin has an inhibitory effect on the formation of PTS-394 biofilm. For HLE434, it mainly promotes the formation of biofilm.

Key words：Bacillus；Surfactin；Separation and purification；Biofilm

目 录

前 言 1

1 文献综述 3

1.1生防芽孢杆菌的研究现状 3

1.2脂肽类抗生素的分离纯化方法研究进展 3

1.3表面活性素及其应用 4

1.3.1在食品工业中的应用 4

1.3.2在医疗中的应用 4

1.3.3在农业中的应用 4

1.3.4在洗涤用品和化妆品工业中的应用 5

1.3.5在石油工业中的应用 5

1.3.6在环境保护方面中的应用 5

2 材料与方法 6

2.1 试验材料 6

2.1.1 菌株 6

2.1.2 培养基配方 6

2.1.3 试验相关试剂、仪器 6

2.2 脂肽类抗生素的分离、纯化 7

2.2.1 脂肽类抗生素粗提物的制备 7

2.2.2 脂肽类抗生素的分离 7

2.2.3脂肽类抗生素的纯化 8

2.3 脂肽类物质的质谱检测 8

2.4表面活性素对芽孢杆菌生物膜形成的影响 8

3 结果与分析 10

3.1 Bs916在LB中产表面活性素的最佳发酵时间 10

3.2 脂肽类抗生素的分离和纯化 10

3.2.1 含有目标化合物最多溶液的初步确定 10

3.2.2目标化合物的进一步纯化 11

3.3 甲醇洗脱液分离纯化脂肽类物质的主成分质谱分析 12

3.4 表面活性素（Surfactin）对生物膜形成的影响 12

结 论 14

致 谢 15

参考文献 16

前 言

几十年来，我国过量施用化肥、农药等化学物使土壤微生物区系受到很大破坏，在农田土壤上表现为：土壤养分的生物转化能力越来越弱，农作物对化肥供给养分的依赖越来越强；在经济作物土壤上表现为：土传病害越来越严重，田地利用率低下，影响了我国农业的可持续发展。随着作物种植年限的不断増加，土壤养分失衡、次生盐渍化和酸化等问题也都逐渐出现，严重危害生态环境。近几年来，植物根际促生菌在农业领域中得到越来越多的关注，不仅因为它能促进植物生长、防控土传病，而且因为它还具有环境友好和安全无毒的特点^[1]。

植物根际促生菌是一类定殖于植物根际，具有促进植物生长能力的细菌的总称^[2]。根据它定殖于根际的位置，可分为两大类：一类是胞内植物根际促生菌，通常只局限地定殖于植物某些特殊组织或细胞内，形成根瘤，相关报道最早可追溯到19世纪80年代，Beijerinck从植物根瘤中分离出第一株根际细菌^[3]；另一类是胞外植物根际促生菌，定殖于根系细胞外，不形成根瘤，但能通过产生信号物质直接促进植物生长，加速土壤元素循环和提高植物抗性，相关研究主要集中于芽孢杆菌属、假单胞菌属和欧文氏菌属^[4]。

自然界中，微生物可以产生一系列的生物表面活性剂，其通常是一类复合的酯类物质，目前按照结构划分可分为6大类，比如脂肽、糖脂或磷脂等。现研究最多的是脂肽类抗生素，主要由芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属的细菌产生^［5］，含有由亲水性氨基酸和疏水性脂肪酸链组成的特殊分子结构，表现出亲水和亲脂的两亲性，具有抗菌和抗病毒等多种生物学活性，在农业、医学等领域具有良好的应用潜力^[6]。