摘 要

本文以黄叶银杏母株黄叶为试材、绿叶为对照，主要分析其色素含量、内源激素、保护性酶活性和萜类内酯含量等生理指标年变化规律，旨在分析黄叶银杏在特定发育阶段的代谢特点，从生理生化角度去探讨黄叶银杏的突变原因，以期为黄叶银杏叶片呈色机理的研究提供理论依据。结果表明：在整个生长期，黄叶中叶绿素a、b以及叶绿素总含量始终低于绿叶，叶绿素a/b比值始终高于绿叶。类胡萝卜素/叶绿素（Car/Chl）比值始终高于绿叶，是导致叶色黄化的主要原因。随着季节的变化，各色素含量及比例发生了变化，黄叶叶色出现返绿现象。黄叶中内源激素吲哚-3-乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）和玉米素核苷（ZR）的含量与叶绿素含量呈显著正相关，脱落酸（ABA）与Car呈显著正相关，IAA、GA3与Car/Chl呈显著负相关。绿叶中各激素含量与叶绿素和类胡萝卜素的含量并无显著相关性。SOD和POD在黄叶和绿叶中的变化趋势相似，黄叶中超氧化物歧化酶（SOD）及过氧化物酶（POD）的酶活性在生长季节的变化幅度明显高于绿叶，然而POD活性变化幅度明显低于绿叶。

关键词：银杏；光合色素；内源激素；抗氧化酶

Study on the Changes of Endogenous Hormones and Secondary Metabolites at Different Developmental Stages

of Ginkgo Biloba 'Aurea'

ABSTRACT

In this study, content of photosynthetic pigment, endogenous hormone, protective enzyme activity and terpenoid lactones contents of the yellow-colour leaf (YL) and green-colour leaf (GL) variations at different developmental periods were analyzed. Throughout the growing season, the content of  carotenoids(Chl) a, b and total Chl in YL were significantly lower than GL, and the chlorophyll(Car)/Chl and chl a/b ratio were significantly higher than GL, which may be the major cause for yellow leaf color. The content of indole-3-acetic acid(IAA), gibberellin(GA3) and trans-Zeatin-riboside(ZR) in YL had significantly positive correlation with Chl, the content of ABA had significantly positive correlation with Car, and the content of IAA and GA3 had significantly negative correlation with Car/Chl. But in GL, the content of mineral elements and endogenous hormone had no significant correlation with all pigment contents. The activity of Superoxide Dismutase(SOD) and Peroxidase(POD) in YL and GL had a similar trend as the season changed. The change amplitude of POD activity of YL was significantly lower than that of GL, and the change amplitude of SOD activity was significantly higher than that of GL.

Key words: Ginkgo; Photosynthetic pigments; Endogenous hormones; antioxidase

目 录

前 言 - 1 -

1绪论 - 2 -

1.1 叶色突变体的类型及来源 - 2 -

1.1.1 叶色突变体的类型 - 2 -

1.1.2 叶色突变体的来源 - 2 -

1.2影响金叶植物叶色形成的环境因素 - 3 -

1.2.1非生物因素 - 3 -

1.2.1.1光照 - 4 -

1.2.1.2温度 - 4 -

1.2.1.3 土壤 - 5 -

1.2.2 生物因素 - 6 -

2 材料与方法 - 7 -

2.1 试验材料 - 7 -

2.2 试验方法 - 7 -

2.2.1 内源激素含量的测定 - 7 -

2.2.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 - 8 -

2.2.3 过氧化物酶（POD）活性测定 - 8 -

2.2.4 萜类内酯含量的测定 - 9 -

2.2.5 光合色素含量的测定 - 9 -

2.3 数据统计分析 - 10 -

3 结果与分析 - 11 -

3.1 内源激素含量的比较 - 11 -

3.2 色素与其他内含物的相关性分析 - 13 -

3.3 SOD和POD活性的比较 - 14 -

3.4 萜类内酯含量的比较 - 15 -

讨论与结论 - 17 -

致 谢 - 18 -

参考文献 - 19 -

前 言

叶色变异在植物中是一种比较常见的突变性状，迄今为止在多种植物中先后发现了一类特殊的黄化突变体，具有突变频率较高，易于鉴定等特点。这类突变体一般是由于叶绿素合成或降解途径受到直接或间接影响，使叶片叶绿素含量降低，通常为叶绿素缺陷突变体（Chl-deficient mutant）。目前，对金叶植物的研究集中在模式植物中，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、番茄（Solanum lycopersicum）、玉米（Zea mays）、小麦（Triticum aestivum）等，主要从叶片结构、叶绿体发育、光合生理变化和遗传特性等方面展开了大量研究。叶色突变体是基础研究的理想材料，不仅在分析鉴定基因、蛋白功能和互作方面有着重要的价值，在育种工作中也具有重要的利用价值。目前，国内外研究者对叶色突变体的突变机理做了大量的研究。由于叶色变异通常会影响突变体的光合作用，使植物发育迟缓，抵抗力下降，开始并没有引起重视。然而随着对叶色突变体研究的不断深入，叶色突变体逐渐体现出其重要性，并在生产中得到应用。如叶色变异性状在育种中可作为标记性状，简化良种繁育和杂交育种；某些叶色突变体因具有优良性状可作为新的种质资源开发利用。植物叶色突变体叶色变化只是突变的外在表现，其呈色原理比较复杂，直接原因是叶片中的色素种类和含量发生变化。叶色突变体叶色的改变必然伴随着一系列的生理生化特性的改变，如色素、矿质元素、内源激素等，是其叶色形成的物质基础。目前对彩叶植物呈色机理研究较多，但是对金叶植物的叶色成因及其生理生化变化研究较少。本文以黄叶银杏母株黄叶为试材、绿叶为对照，主要分析其内源激素和保护性酶活性等生理指标年变化规律，旨在分析黄叶银杏在特定发育阶段的代谢特点，从生理生化角度去探讨黄叶银杏的突变原因，以期为黄叶银杏叶片呈色机理的研究提供理论依据。

1绪论

1.1 叶色突变体的类型及来源

1.1.1 叶色突变体的类型

在植物中，叶色突变体的种类较多，性状比较明显，通过直接观察叶片颜色即可鉴别。叶色突变体的分类标准多样，根据叶色表型可将其分为白化、条纹、黄化、淡黄绿、淡绿、常绿、斑叶、紫叶、类病斑、白黄、白绿等类型^[1]。根据色素含量的变化和比例可分为总叶绿素缺乏型、总叶绿素增加型、叶绿素b缺乏型以及类胡萝卜素缺乏型^[2]。由于类胡萝卜相对于叶绿素较为稳定，故类胡萝卜素缺乏型突变体在植物中较为少见。还有研究发现，有些叶色突变体叶色的变异与温度和光照密切相关。有些叶色突变体的表型因光照周期和光照强度的不同而变化，表现为光敏型，包括光周期敏感型和光照强度敏感型；另一类突变体因温度的改变而引起色素缺失，表现为温敏型；还有一类突变体对光照和温度都比较敏感，表现为光敏互作型^[3]。景晓阳等^[4]根据温度对叶色表型的影响，将8个籼型水稻叶色突变系划分为叶色突变高温表达型、低温表达型及温钝型3种类型。白茶根据白化诱导因素不同，可分为温度敏感型、光照敏感型和光温不敏型三种^[5]。由于叶色突变体叶色的变化容易识别，故依照苗期的叶色表型分类是最为常用的分类方法。但是随着新的叶色突变体不断的被发现，依照叶色变异的分类方式难以对突变体进行准确命名。如目前发现的水稻白转绿、小麦返白系、小麦黄化转绿等叶色突变体在苗期叶色会逐渐发生变化^[6]。目前为止，还未提出比较合理的分类标准，大多数研究者仍然按照叶色表型，较为直观地去划分叶色突变体。

1.1.2 叶色突变体的来源

植物中叶色突变体的来源比较广泛，其产生方式主要包括自然突变、诱发突变、插入突变和基因沉默突变等^[7]。自然突变又称自发突变，是指植物在外界自然条件发生变化的情况下产生的突变，如温度剧变、雷电、自然辐射和环境污染等，大多为单基因突变。虽然叶色的自然突变在植物中广泛存在，但是其自然突变频率较低，限制了叶色突变体在遗传模式和变异机理上的研究。目前，最常用的叶色突变体获得方式是人工诱导，能够增加突变频率，在较短时间内获得大量叶色突变体。诱发突变是人工诱变突变体的主要方式，主要利用物理手段（X射线、γ射线、太空诱变、紫外线、激光等）和化学手段（乙烯亚胺、亚硝酸、链霉黑素、硫酸乙酯等）使基因突变，是创造新种质资源的主要途径。陈善福等^[8]通过⁶⁰Co-γ射线来照射龙特甫B的干种子，获得了黄化、白化和条纹等6种类型叶色突变体。陈天龙等^[9]应用甲基磺酸乙酯（ethylmethanesulfonate, EMS）诱导诱变蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）种子，获得叶斑、杂色、深绿、红紫、黄化和白化等叶色突变性状。插入突变是将某些元件插入植物基因组从而引起的叶色突变，常用的插入元件有转座子、T-DNA、逆转座子等^[10]。Chern等^[11]用粳稻品种台农67构建了一个包含近55000个株系的T-DNA/Tos17插入突变体库，获得了白化、黄化、深绿、浅绿、蓝绿、条纹、斑马叶等多种类型的插入突变体。由于插入突变方式建立在转基因技术基础上，涉及到了转基因安全问题，因此这种方式诱导的叶色突变体，需要在用于生产之前进行安全性评价。基因沉默突变是通过抑制目的基因表达而产生的基因功能缺陷突变体，基因沉默在叶色突变体诱导中应用较少，目前仅从拟南芥和烟草（Nicotiana benthamiana）等少数植物中获得叶色突变体^[12]。

1.2影响金叶植物叶色形成的环境因素

影响植株叶色变化的因素大致可以划分为非生物因素和非生物因素两种。其中非生物因素包括气候、土壤、温度、湿度、土壤矿质元素及pH值等，生物因素包括真菌、病毒、昆虫等。下面将就各个因素分别阐述。

1.2.1非生物因素

外界的非生物因素亦可称之为环境因素。环境因素通过改变植物体内相关代谢平衡，调节各种色素的成分和比例，进而暂时或永久的改变植物叶片的颜色。环境因素导致植物叶色变化的一个重要现象即植物春叶色及秋叶色的形成。下面将就各环境因子分别阐述。

1.2.1.1光照

光是影响植物叶色变化的最直接和最重要的环境因素。光照强度及光照时间等因素都会导致植物叶色的变化^[13]。祁海艳等^[14]研究不同光照强度下中华金叶榆(Ulmus pumila cv. jinye)叶片颜色变化规律。结果表明随光照强度的降低叶片颜色由黄转绿并不断加深。李红秋等^[13]研究表明，在遮阴的条件下金叶女贞和金叶接骨木(Sambucus racemosa Plumosa Aurea)叶色叶色较浅，不遮阴树叶色较深呈现金黄色；同一植株树冠上部叶色变化较下部快。此结果说明叶片颜色的变化可能是由于叶片接受的不同光强所致。钟传飞等^[15]发现阳生的金叶女贞在遮阴后复绿，而生长在冠层下部弱光环境下的叶色始终保持绿色，此现象表明，金叶女贞属于光敏型突变种，突变后的叶片在强光下，叶绿素的合成或降解过程发生变化，导致叶色呈金色[16]。此外在研究金叶榕(Ficus microcabacv)^[17]、金边大叶黄杨(Euonymus japonicus cv. Ovatus Aureus)^[18]、金叶连翘(Forsythia koreana ‘Sun Gold’)^[19]的过程中也发现了叶片的颜色对光强的响应表现不同。胡海姿等^[20]按照金叶叶色对光强的响应将金叶植物划分为光强不敏感型、光强敏感型、光强高度敏感型，其中光强不敏感型植物起源于热带，光敏感型起源于暖温带，光高度敏感型起源于温带。在探讨光照时间也植物叶片成色的关系时，李红秋等^[13]研究发现日照时间达12 h以上时，叶片颜色变化更为明显，叶色更为艳丽。综上研究表明，在高光强的条件下，有利于金叶植株叶片的成色。光照作为影响植物叶色变化的重要环境因素已经得到了证明，但作用机理仍需要进一步的证明。

1.2.1.2温度

温度对于植物呈色有一定的影响^[21]。叶绿素的温度的稳定性差，而类胡萝卜素相对稳定，因此温度是决定植物秋叶色形成的主要原因。温度直接调控色素之间的组成和比例，或通过调节光合与呼吸的强弱，影响碳水化合物的积累，从而调节花青素的合成，进而影响植株叶片成色。刘贵富等^[22]在研究60Coγ射线辐射水稻突变体时，发现叶色的表达与温度有关，W4、W11在高温(30~35℃)叶片呈白色，在低温下(20~25℃)表现为黄色或浅黄色；相反，突变体W17和W25在低温下表现为白色，高温下转为浅绿色；无论哪一种类型，在适宜的温度下，其叶片在生长过程中又可以转化为黄绿色或绿色。文祥凤等^[23]研究发现黄素梅(Duranta repens cv. Gold leaves)在气温较低时，叶片呈浅黄绿色，叶绿素a含量高于叶绿素b，且叶绿素总量也超过类胡萝卜素；随着气温的升高叶片内类胡萝卜含量显著增加，叶片呈现金黄色。然而在低温下，黄金榕(Ficus microcarpa cv. Golden Leaves)叶片中类胡萝卜素显著大于叶绿素总量，叶片呈现黄色与橙红色的中间色，随着温度的升高，叶绿素及类胡萝卜素的含量具有升高但叶绿素b和类胡萝卜素所占比例仍较大，叶片仍以黄绿色和橙黄色之中间色，叶片依旧金黄艳丽。综合以上研究表明，黄叶植株叶片在不同的温度下可能呈现不同的颜色，产生此现象的原因有待进一步的证实。

1.2.1.3 土壤

袁涛等^[24]研究发现，当土壤pH值lt;6.7时，金叶莸(Caryopteris clandonensis ‘Worcester Gold’)叶色暗淡，黄绿色无光泽；pH值为6.7~8.3之间时，叶呈金黄色，且有光泽，并逐渐转为黄绿色；当pH值gt;8.3时，叶呈黄绿色至淡褐绿色。由此推论微酸性土或中性的湿润土壤可促进彩叶植物叶片的呈色，碱性土壤则抑制呈色。