摘 要

模式识别受体（PRRs）是存在于植物细胞表面的，能识别病原微生物和进行防御应答的第一层天然免疫系统。最典型的便是识别细菌鞭毛蛋白的受体类蛋白激酶FLS2，FLS2的细胞外富含亮氨酸重复结构域，与细菌鞭毛蛋白保守的N末端序列结合，可以触发植物产生一系列基础的防御应答反应。杨树是主要的人工造林树种，也是木本模式植物。杨树PtFLS2基因可以通过可变剪接产生3种不同的转录本异构体，通过构建植物表达载体，利用农杆菌介导的叶盘转化法将异构体转入本氏烟草中过量表达。另外将杨树PtFLS2 gDNA在本氏烟草中瞬时表达，提取蛋白利用western杂交技术来检测经过可变剪接后翻译的蛋白量大小。阐明杨树PtFLS2基因的调控机制，可以为有目的调节杨树和其他木本植物的免疫系统对抗病原微生物提供理论基础。

关键词：杨树；FLS2

Functional Analysis of FLS2 Gene from Populus

ABSTRACT

Pattern recognition receptors (PRRs) are the first layer of innate immune systems that exist on the surface of plant cells, which can recognize pathogenic microorganisms and conduct defense responses. The best-characterized is that the extracellular leucine-rich domain of the receptor- protein kinase FLAGELLIN SENSING 2 (FLS2), which appreciates the bacterial flagellin, binds to the conserved N-terminal sequence of the bacterial flagellin and triggers plant to produce a series of defense response. Populus is the main tree species of afforestation and it is also a woody model plant. PtFLS2 gene can be produced by alternative splicing of three transcript variants, the construct was overexpressed in Nicotiana bethamiana leaves using agrobacterium-mediated transformation. In addition, PtFLS2 gDNA was transiently expressed in Nicotiana bethamiana, then use western blot to detect the amount of protein translated after alternative splicing. Revealing the regulation mechanism of PtFLS2 gene can provide a theoretical basis for the purpose to regulation the immune system against pathogenic microorganisms.

Key words：populus； FLS2

目 录

1 前言 1

1.1 可变剪接的研究进展 1

1.1.1 可变剪接的位点 1

1.1.2 可变剪接的识别 1

1.1.3 可变剪接的意义 2

1.2 FLS2的研究进展 3

1.2.1 植物的免疫系统 3

1.2.2 植物的模式识别 4

1.2.3 FLS2的发现及其结构 4

1.2.4 FLS2的功能 5

1.3 本课题研究的意义 6

2 PtFLS2三种可变剪接异构体的烟草转基因实验 7

2.1 实验材料、设备及试剂 7

2.1.1 实验材料 7

2.1.2 设备与试剂 7

2.2 实验方法 7

2.2.1 载体构建 8

2.2.1.1 提取DNA 8

2.2.1.2引物设计及克隆目的基因 8

2.2.1.3大肠杆菌转化及质粒提取 10

2.2.2 烟草转基因实验 11

2.2.2.1 制备转化液 11

2.2.2.2叶盘转化 11

2.2.2.3转基因烟草的检测 12

2.3 结果分析与讨论 13

3 PtFLS2蛋白的提取及western blot检测 16

3.1 实验材料、设备及试剂 16

3.1.1 实验材料 16

3.1.2 设备与试剂 16

3.2 实验方法 17

3.2.1 PtFLS2蛋白提取 17

3.2.2 western blot检测 18

3.3 结果分析与讨论 18

结论 21

致谢 22

参考文献 23

1 前言

植物依赖于两层天然免疫系统来识别病原微生物和进行防御应答^[1、2]。第一层防御系统是依赖于存在细胞表面的模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）。例如，识别细菌鞭毛蛋白的受体类蛋白激酶FLS2（flagellin sensing 2）, FLS2的细胞外富含亮氨酸重复结构域，与细菌鞭毛蛋白保守的N末端序列结合，可以触发植物产生一系列基础的防御应答反应。第二层防御系统是位于植物细胞内，利用细胞内的NB-LRR类型的抗性蛋白，识别细菌特有的效应因子蛋白，触发剧烈的免疫应答，例如可以导致局部细胞死亡的超敏反应（hypersensitive response，HR）。

本章将对可变剪接意义和FLS2基因功能进行总结，提出目前他人研究的空白之处，以及研究的难点。

• 1. 可变剪接的研究进展

在高等真核生物基因组中存在大量的割裂基因，而这些割裂基因的mRNA却是非割裂结构，在这个转化过程中除去内含子的过程就称为剪接。对于同一个基因，由其剪接位点和拼接方式不同而导致同一个基因可以表达出多个不同的相关蛋白产物，行使不同的生理功能的过程，称为可变剪接^[3]（alternative splicing，AS）。

• • 1. 可变剪接的位点

真核基因在结构上是不连续的，前体mRNA(Pre-mRNA)通过可变剪接产生不同的转录本, 这些转录本进一步翻译, 成为结构、功能各异的蛋白亚型(isoform) ^[4]。由于RNA的可变剪接不涉及到遗传信息的永久性改变，所以是真核基因表达调控中一种比较灵活的方式。同一前体mRNA在产生成熟mRNA的过程中去除内含子的方式可能不同，这种机制最早在1978年由Walter Gillbert首先描述。可变剪接被认为是导致蛋白质功能多样性的重要原因之一，它使一个基因可编码多个不同转录产物和蛋白产物。果蝇(Drosophila melanogaster)的Dscam基因^[5]是描述AS产生多样性的典型例子，它有4处可变外显子，每个转录每组只提供一个形式，理论上可达到约38016个剪接变体。

• • 1. 可变剪接的识别

真核细胞核内前体mRNA加工通过5′加帽、剪接（移除内含子）、3′末端切割加尾，从而形成成熟的mRNA，成熟的mRNA和hnRNP（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein）及其他蛋白质形成复合体输出核外再经过选择性降解参与翻译。一般认为，可变剪接有5种基本形式^[3]（如图1.1）：①内含子保留；②可变的5′端；③可变的3′端；④外显子盒；⑤互斥外显子（一组外显子中只选其一）。

图1.1 可变剪接的基本形式（邱莫寒等,2010）