摘 要

东京野茉莉（Styrax tonkinensis）是近年来备受关注的生物质能源树种。为研究东京野茉莉种子生长发育各个时期的脂质积累规律及油体大小、分布规律，我们对不同时期东京野茉莉种子进行体视解剖、透射电镜观测，并用Image J软件分析获得不同时期东京野茉莉种子油体大小及面积。为获油体得最佳观察方法，我们选择不同的染色方法及切片方法。试验结果表明：（1）东京野茉莉种子在花后25天出现种皮，花后60天种子开始形成胚乳，花后70天胚乳体积迅速增加，花后79天种子中开始出现胚根，花后86天种子中开始出现子叶；（2）油体的产生与细胞中的蛋白体具有一定的相关性，这些蛋白在不同的时期电子密度有所不同；（3）东京野茉莉种子成熟过程中细胞核及液泡逐渐消失，在脂质积累前期细胞器数量出现增加，细胞充满油体后迅速消失；（4）东京野茉莉种子充满油体之前，脂肪积累的同时淀粉粒也持续增加。(5)通过观察发现，采用尼罗红染色-激光扫描共聚焦显微镜观察能获得油体大小、形态及分布情况等基本信息，通过柠檬酸铅-醋酸铀双染透射电镜观察能得到细胞中油体周围小环境情况，同时获得各个细胞器的形态特征，掌握油体的发生、发育情况。实验还发现，超薄切片与透射电镜技术结合进行观察，适合分析种子中各器官和物质的形态变化；尼罗红染色对分析种子中油体大小及形态分布有特异性。

关键词：东京野茉莉；油体；蛋白质；显微观察

Microscopic observation of oil formation in the developing Styrax tonkinensis seeds

Abstract

Styrax tonkinensis is the biomass energy trees which has attracted more and more attention in recent years.We chose Styrax tonkinensis seeds which were at different developmental periods for observing lipid accumulation patterns by using stereoscopic dissect and transmission electron microscope(TEM) .The size of seed oil body was analyzed by using image J software. The results were shown as follows：(1)We could find the testa in 25 DAF (days after flowering),the endosperm of Styrax tonkinensis seed appeared in 60 DAF,endosperm increased rapidly at 70 DAF .Radicle and cotyledons respectively appeared at 79 DAF and 86 DAF.(2) The production of oil body and proteins had a certain relevance, the density of proteins was different at different period.(3) During the mature priods of Styrax tonkinensis seeds, the nucleus and vacuole disappeared gradually,organelles increased in the early stage of the accumulation of lipid and disappeard after the cells were filled with the oil body.(4)The starch grains continuesly increased before oil become full in cell,(5)The results revealed that size and distribution of oil bodies and other basic information could be observed using laser scanning confocal microscope with sections stained by Nile red. And the micro-environment around oil body could be seen using transmission electron microscope with sections stained by citrate-uranyl acetate. At the same time, morphological characteristics of every organelles could be obtained and the information of oil body initialization and development could also be known. The study also found that :semi thin sections observed with transmission electron microscope(TEM) were suitable to explore morphological changes of various organelles and seed reserved nutrients. Nile red staining was a distinctive method for analyzing size, shape and distribution of oil body.

Key words: Styrax tonkinensis; Oil bodies；Protein body；Microscopic observation

目 录

1 文献综述

1.1 东京野茉莉生物学特性

1.2 植物果实发育学研究

1.2.1 果实的形成

1.2.2 种子的成熟

1.3 植物油体研究现状

1.3.1 油体的观察

1.3.2 油体与种子含油量的研究

1.4 研究目的与意义

1.5 技术路线

2 材料与方法

2.1 供试材料

2.2 实验药品与主要仪器

2.3 实验方法

2.3.1东京野茉莉种子发育过程中的解剖结构观察的实验方法

2.3.2东京野茉莉种子透射电镜观察的实验方法

2.3.3 不同时期东京野茉莉胚乳细胞油体面积观察的方法

2.3.4东京野茉莉油体形态观察方法

3实验结果

3.1 解剖观察实验结果

3.2东京野茉莉种子透射电镜观察实验结果

3.3 不同时期东京野茉莉胚乳细胞油体面积观察实验结果

3.4东京野茉莉种子油体形态观察方法的比较

3.4.1不同制片方法、染色剂染色及观察条件下东京野茉莉种子油 体的观察

3.4.2不同制片方法及观察条件下东京野茉莉种子细胞结构及内含物的观察

3.4.3不同切片方法、染色方法的比较

5 讨论

6 本研究存在的问题

参考文献

致谢

1 文献综述

1.1 东京野茉莉生物学特性

东京野茉莉（Styrax tonkinensis），又名越南安息香、白花树、白野茉莉，属安息香科安息香属落叶小乔木,主要分布于热带和亚热带海拔 100-1 000 m 的低山丘陵区，在我国江西、福建、贵州、广东、广西、湖南和云南等地均有分布(中国科学院中国植物志编辑委员会，1987；傅立国等，2003）。2-3 龄树始花始果。5 月开花，柔荑花序于夏梢叶腋，每花序有小花 1-25 枚，形似茉莉花，白色、清香。11 月果熟，蒴果，果径 1-1.5cm，果皮灰白色，有波纹，呈不规则开裂，每果内有种子 1-2 个，呈椭圆形，种径 0.5-1cm，单重 1g，种皮锈褐色，鲜种仁白色（吴克选，2002；戴晓龙，2001，2002）。 东京野茉莉种子含油率高达51％，是加工生物柴油的良好原料（徐京萍，2009）。种子内脂肪酸主要有油酸、亚油酸、棕榈酸和花生酸，其中以不饱和脂肪酸为主，总含量达 85.4%，亦含有丰富矿质元素和维生素，具有较高的营养价值（肖复明，2005）。

1.2 植物果实发育学研究

植物的果实是被子植物特有的繁殖器官，由受精雌蕊的子房发育而成，具有保护和散播种子的作用。不同类型的果实结构、发育过程和形成机制也不同。被子植物受精后胚珠发育为种子，子房壁发育成果皮，胚珠发育成种子，与此同时子房新陈代谢开始活跃，生长迅速，发育成果实，形成果皮包着种子:果实。学者们通过研究植物发育过程中营养器官的生长发育、果实和种子的形成，来寻找控制植物生长发育、开花结实并提高植物生产能力，获得改善果实、种子品质的新思路、新手段（李正理，2012；陆时万等，1991）。

1.2.1 果实的形成

被子植物经开花、传粉、受精后，植物的胚胎开始形成，此时意味着植物发育进入了种子阶段。种子由胚珠发育形成，与此同时子房发育形成果实，受精极核(中央细胞)发育为胚乳，由珠被发育为种皮。胚、胚乳(或无)和种皮共同构成种子。真果类种子花萼、花冠、雄蕊、雌蕊的柱头及花柱等均枯萎凋谢；而假果类植物除子房外，花的其他部分也参与果实的形成。果皮通常可分为3层，由外向内分别为外果皮、中果皮和内果皮。不同类型的果实生长速率有所差异，果实生长所需要的时间也不同。一种作物在不同环境条件，甚至在不同发育时期，果实的生长速率也不尽一致（Stephen，2010；韩碧文，2003）。

果实生长包括细胞数量的增加及细胞体积的增加。果实生长的曲线分为S形曲线和双S曲线两种类型。S形曲线果实在果实生长初期速度较慢，以后逐渐加快，大小变化呈指数增加，随后生长减缓，这种慢一快一慢的生长表现是与果实中细胞分裂、膨大以及分化成熟的节奏一致的，苹果、香蕉、芒果等果实的生长曲线属于此种类型；双S曲线类型果实则呈现一种慢一快一慢一快一慢的生长表现，果实生长分为三个阶段，在第一阶段，果实的子房、珠心和珠被生长迅速，但胚和胚乳基本不增加；第二阶段，胚和胚乳生长迅速，子房的大小变化不大；第三阶段，果实开始了子房发育的新高峰，之后果实继续发育至成熟。