摘 要

希金斯炭疽作为世界性的病原真菌，主要寄生在十字花科植物，引发炭疽病，造成农作物及林业上的经济损失。蛋白激酶是细胞感受外界信号的主要分子，主要功能是使下游信号蛋白磷酸化，把细胞外的信号传入细胞内，再通过影响基因转录来达到多种生物学功能。目前，该类基因在真核细胞的模式生物酵母中有着较为充分的研究，但关于该类基因在植物病原真菌中的功能还不清楚。本研究以希金斯炭疽病菌为材料，开展激酶蛋白ChMCK1的生物学功能学研究。

本研究通过基因敲除获得缺失ChMCK1的突变体，之后进行了一系列的生物表型分析，结果表明该基因对分生孢子的形成有显著地调控作用，并且对真菌营养吸收率有较大的影响。

关键词；激酶蛋白；基因敲除；希金斯炭疽；ChMCK1

Functional study of ChMCK1 in Colletotrichum higginsianum

ABSTRACT

Colletotrichum higginsianum, as one kind of world-wild pathogenic fungi, mainly parasites in Cruciferae plants which caused economic losses in agriculture and forestry. Protein kinases are important for receptive cells to get signals from outside environment. The main function of kinase proteins is phosphorylating the downstream signaling proteins and the releasing the extracellular signals into the cells and finally achieve a variety of biological functions through their effects on gene transcription. At present, this kind of gene is fully studied in the model organism yeast of eukaryotic cells, but it is not clear about the functions of this kind of gene in the plant pathogenic fungi. In this study, the biological function of protein ChMCK1 was studied. We obtained mutants through gene knockdown method. After a series of biological phenotype analysis, the results showed that this gene participate in the formation of conidia and have significant regulatory role in the nutrient absorption in C. higginsianum.

Key words：Kinase protein; gene knockdown; anthrax; ChMCK1

目 录

1 前言………………………………………………………………………………………1

2 实验材料与方法………………………………………………………………………………3

2.1实验材料……………………………………………………………………3

2.1.1 实验用真菌菌株 ……………………………………………………………………3

2.1.2 相关试剂……………………………………………………………………………………3

2.1.3 仪器设备……………………………………………………………………………………3

2.2 试验方法与操作规范…………………………………………………………………………3

2.2.1 希金斯炭疽的培养与菌丝DNA的提取…………………………………………………3

2.2.2基因序列分析 ………………………………………………………………………………3

2.2.3基因敲除载体的构建 ………………………………………………………………………4

2.2.4炭疽菌原生质体的转化与ChMCK1缺失突变体的筛选 …………………………………8

2.2.5希金斯炭疽缺失ChMCK1突变体的生物学表型分析 ……………………………………9

2.2.6突变体的产孢能力测定 ……………………………………………………………………10

3 结果与分析………………………………………………………………………………11

3.1 ChMCK1基因敲除载体的构建和转化…………………………………………………………11

3.2 ChMCK1的基因的功能学分析…………………………………………………………………11

3.2.1 ChMCK1d对希金斯炭疽营养生长的的影响………………………………………………11

3.2.2 ChMCK1的缺失对产孢量的影响 ………………………………………………………13

3.2.3 ChMCK1突变体对胁迫物质的生长反映 ………………………………………………13

3.2.4 ChMCK1缺失对希金斯炭疽细胞壁完整性的影响 ……………………………………16

3.3 ChMCK1基因的表达定位分析…………………………………………………………16

结果与讨论……………………………………………………………………………………………16

致谢………………………………………………………………………………………………17

参考文献………………………………………………………………………………………18

1 前 言

炭疽病是园林及经济植物经常发生的一大类病害，主要为害植物的叶片，有时也为害茎和嫩枝。为害严重时，降低植物观赏价值和经济价值，甚至引起植株死亡。此病由于有潜伏侵染的特征，早期一般不易被发现。因此，有时常常会失去早期防治机会，造成一定损失。炭疽病主要为害园林植物有大叶黄杨、非洲茉莉、广玉兰、白三叶、海棠、芦荟、仙人掌、泡桐、石榴，另有多种经济作物。

炭疽病主要发生在植物叶片上，常常为害叶缘和叶尖，严重时，使大半叶片枯黑死亡。发病初期在叶片上呈现圆形、椭圆形红褐色小斑点，后期扩展成深褐色圆形病斑，大小为1至4毫米，中央则由灰褐色转为灰白色，而边缘则呈紫褐色或暗绿色，有时边缘有黄晕，最后病斑转为黑褐色，并产生轮纹状排列的小黑点，即病菌的分生孢子盘。在潮湿条件下病斑上有粉红色的黏孢子团。严重时一个叶片上有十多个至数十个病斑，后期病斑穿孔，病斑多时融合成片导致叶片干枯。病斑可形成穿孔，病叶易脱落。