摘 要

本试验利用MSAP技术对马罕、金华、波尼、斯图尔特、肖尼等5个薄壳山核桃品种进行了DNA甲基化水平及模式的研究，以期为薄壳山核桃品种的鉴定与分类提供重要依据。试验结果表明：

1、5个薄壳山核桃品种共检测到4种胞嘧啶甲基化类型，分别为非甲基化类型、半甲基化类型、全甲基化类型、甲基化不确定类型，本研究仅分析讨论其前3种甲基化类型。

2、薄壳山核桃品种总体DNA甲基化水平为48.48%~63.90%，品种间总体DNA甲基化水平不同，堪萨最高，金华最低。其中，外侧胞嘧啶甲基化（全甲基化）水平为23.46%~48.68%，内侧胞嘧啶甲基化水平（半甲基化）水平为15.22%~27.44%。

3、不同引物间扩增总条带数有较大差异，引物H/M-TAC~E-ACA扩增总条带最多，达205条；引物H/M-TTC~E-AGC扩增总条带数最少，为91条。16对引物扩增的条带多态性水平均较高，总体性水平为70.00%~89.27%；不同引物扩增出的甲基化多态性条带数量略有差异，引物H/M-TAC~E-ACA扩增的多态性条带最多，达183条，引物H/M-TTC~E-AGA扩增的多态性条带最少，为70条。

关键词：薄壳山核桃；DNA甲基化；MSAP技术

A comparative study of different varieties of pecan DNA methylation level and pattern

ABSTRACT

In this experiment, MSAP technique was used to study the DNA methylation level and pattern of Mahan, Jinhua,Pawnee,Stewart,Shawnee five pecan cultivars. With a view to the identification and classification of pecan varieties offer Important reference .The results showed that：

1. 5 pecan varieties were detected four kinds type of methylation of cytosine, respectively unmethylated type, semi-methylated type,all types of methylation, methylation uncertain type, the present study only analysis and discussion of its firstthree types of methylation.
2. The overall DNA methylation levels pecan varieties as 48.48% ~ 63.90%, the overall DNA methylation levels in different varieties, Kansas highest, lowest Jinhua. Wherein the outer cytosine methylation (permethylated) level of 23.46% - 48.68%, the inside of the cytosine methylation levels (semi-methylation) level of 15.22% - 27.44%.
3. Different primers are quite different total number of strips, primer H/M-TAC ~ E-ACA total amplified bands highest of 205; primer H/M-TTC ~ E-AGC total amplification bands the least number is 91. 16 pairs of primers amplified polymorphic bands levels were higher, the overall level of 70.00% - 89.27%; different primers amplified polymorphic bands number methylation slightly different primer H / M- TAC ~ amplified polymorphic E-ACA with the highest of 183 polymorphic primers H/M-TTC ~ E-AGA amplified band minimum for 70.

Key words：Pecan；DNA methylation；MSAP

目录

1 薄壳山核桃概况及研究意义 1

1.1 薄壳山核桃概述 1

1.2 薄壳山核桃的国内外发展现状 1

1.3 薄壳山核桃研究的意义 2

2 DNA甲基化研究 2

2.1 DNA甲基化概述 2

2.2 参与DNA甲基化的酶类 3

2.2.1 MET1 4

2.2.2 CMT 4

2.2.3 DRM 4

2.2.4 DNMT2 4

2.3 DNA甲基化研究进展 4

2.4 不同品种DNA甲基化水平差异 5

2.5 DNA甲基化研究方法 6

2.5.1 亚硫酸氢盐法 6

2.5.2 芯片技术方法 6

2.6 MSAP技术 7

3试验材料和方法 9

3.1 试验材料 9

3.2 DNA的提取 9

3.3 DNA质量检测 10

3.4 MSAP流程 10

3.4.1 限制性酶切（20μL反应体系） 10

3.4.2连接反应（25μL反应体系） 11

3.4.3预扩增反应 11

3.4.4 选择性扩增 12

4 结果与分析 14

4.1 不同品种薄壳山核桃DNA甲基化模式分析 14

4.2 不同品种薄壳山核桃DNA甲基化修饰水平的分析 16

4.3 薄壳山核桃甲基化多态性分析 19

5 结论与讨论 20

致 谢 22

参考文献 23

1 薄壳山核桃概况及研究意义

1.1 薄壳山核桃概述

薄壳山核桃(Carya illinoinensis)，又名美国山核桃、长山核桃等，属于胡桃科山核桃属，薄壳山核桃果仁与中国的核桃(Juglans regia)和山核桃(Carya cathayensis)相比，其坚果个大（80~100 粒/kg），壳薄，出仁率高(50%~70%)，取仁容易，果仁口感良好，产量高(1500~2250 kg/hm²)，所含不饱和的脂肪酸和对人体有益的各种氨基酸比油橄榄高，富含维生素B1、B2^[1-2]。薄壳山核桃木材结构细密，纹理致密，坚固强韧，可用作高档木材。此外薄壳山核桃主干端正笔直，耐水性良好，树形优美，可用作行道树木等。

1.2 薄壳山核桃的国内外发展现状

薄壳山核桃原产于美国，在美国是以密西西比流域以及其东西两面支流的河谷地带的自然分布为主^[3]，全美国的50个州中，有约24个州进行薄壳山核桃的商业化生产，但是主要分布在美国南方的几个州如得克萨斯、亚拉巴马、路易斯安娜、佛罗里达、佐治亚及密西西比等。其中种植面积最大的3个州依次为德克萨斯州、佐治亚州和俄克拉荷马州 ^[4-5]。世界其他地区引种的有澳大利亚、南非、埃及、秘鲁、巴西、西欧及中东等国家和地区^[6]。全国现有薄壳山核桃商业果园面积约20万hm²，每年的坚果产量在15万～ 18万t ^[7] 。近年来随着薄壳山核桃出口量（尤其是出口中国）的增加及坚果价格的上升，全美薄壳山核桃的种植面积在不断扩大。据不完全统计，2010~2013年近3a新发展的薄壳山核桃种植园面积相当于美国近30a发展面积的总和^[8]。

我国的薄壳山核桃引种历史已达百年，可以追溯到1890年^[9]，迄今已在中国20多个省（区、市）有小面积栽培分布^[10]，但是，发展较好且资源比较集中的主要还是集中在亚热带东部和长江流域。据初步研究^[11]，该树种在秦岭以南，南岭以北的地区具有较强的适应性，现有薄壳山核桃资源约7万株，主要以30年生以上的大树为主，多呈零星分布。从品种(单株)和树木数量看，资源较多的依次是江苏、浙江、云南、陕西、福建、江西和湖南。近几年来，云南、浙江、安徽和江苏等省都对薄壳山核桃产业发展给予了高度重视，并且加大了资金的投入力度。但是过去的一百多年里中国的薄壳山核桃产业发展缓慢，还没有形成规模化，目前国内的薄壳山核桃栽培面积以及种植规模还远远不能满足人们的需求。究其原因是难以将外来的薄壳山核桃品种和中国的环境气候以及栽培方法联系起来，该树种不仅在生态环境上有南北品种和种类之分，产量低下；而且遗传变异大。在薄壳山核桃的栽培中出现了一定的盲目性，造成了在人力、财力和土地资源上的的浪费。所以造成了薄壳山核桃在中国的引种和推广工作进展非常缓慢。因此，我国薄壳山核桃产业尚待发展，其各方面的科学研究都具有显著的现实意义。

1.3 薄壳山核桃研究的意义

目前，薄壳山核桃在国外的市场价格大约为6~7美元/kg，是普通核桃的2~3倍，在中国，价格达到60元/kg，是普通核桃的3~5倍。可见薄壳山核桃无论是在国内还是国外市场都具有非常广阔的市场前景。由于我国在栽培管理以及品种变异方面还有很多问题需要攻克，所以目前国内大规模的薄壳山核桃果园很难见到，国内薄壳山核桃年产不足10吨，所以对于薄壳山核桃的研究和培育显得尤为重要。

2 DNA甲基化研究

2.1 DNA甲基化概述

甲基化是基因组DNA表观遗传的一种主要修饰形式，是基因组功能的重要调节方式。也是最早被发现的表观遗传修饰方法，这种修饰广泛存在于动植物体中^[12]，对基因的表达发挥着重要的作用。DNA甲基化参与了细胞的多种生理活动，比如基因的时空特异性表达、X染色体失活、衰老以及癌症的发生^[13-14]。植物中各种与甲基化相关的表观遗传状态都可以稳定地遗传给后代^[15]。在对不同品种的西红柿及后代DNA甲基化多态性研究中发现，DNA甲基化多态性以孟德尔遗传定律遗传给下一代^[16]，充分证明甲基化是可遗传的。