摘 要

鸟苷酸及其代谢衍生物是胞内核酸合成的底物，也是重要的信号分子。鸟苷酸（GMP）通过鸟苷酸激酶（GKs）和核苷二磷酸激酶 （NDK）催化，分别产生二磷酸鸟苷（GDP）和三磷酸鸟苷（GTP），GTP在鸟苷酸环化酶（GC）催化下，生成胞内重要的信号分子环化鸟苷酸（cGMP）。GKs直接影响GDP/GMP胞内比例，进而影响cGMP的产生。在原核生物、低等真核生物和节枝动物中，GKs非常保守，突变致死。关于GKs在高等生物中的功能目前还知之甚少。为了更进一步了解给基因的功能，挖掘该激酶特征，本课题以突变型拟南芥材料为起始材料，提取突变体植株总RNA，反转录后进行RT-PCR,克隆该基因突变型cDNA序列，以pGEX-4T-1为原核表达载体框架，构建原核表达载体（pGEX-4T-1：：mAtGK1，解析高等植物鸟苷酸激酶体外催化活性对探究鸟苷酸激酶在体内代谢调控机制具有重要的理论意义。

关键字：拟南芥；鸟苷酸激酶；原核表达；载体构建

Construction of prokaryotic expression vector forGMP kinase mutant mAtGK1

Abstract

Guanylic acid and its metabolites are not only the substrate of intracellular nucleic acid synthesis metabolism but also important signal molecules. Guanosine monophosphate (GMP) is catalyzed by guanylate kinase (GSk) and nucleoside diphosphate kinase (NDK) and then respectively diphosphates guanosine (GDP) and guanosine triphosphate (GTP). GTP is catalyzed by guanylate cyclase (GC) and generates important intracellular signaling molecules which are called cyclic guanosine monophosphate (cGMP). GKs directly affect GDP/GMP intracellular ratio, which affect the generation of cGMP. GKs is very conservative and its mutation is lethal in prokaryotes, lower eukaryotes and arthropods. GKs’s function in higher organisms is still poorly understood.we should further understand the function of the gene and excavate the kinase’s feature.In this study the starting material was mutant Arabidopsis material, total RNA was extracted from mutant plants and RT-PCR was performed after reverse transcription, The cDNA sequence of Mutant type gene was cloned,Then the prokaryotic expression vector (pGEX-4T-1 :: mAtGK1) was constructed , its frame is pGEX-4T-1 prokaryotic expression vector frame,parsing in vitro catalytic activity of guanylate kinase of higher plants has important theoretical significance to explore in vivo metabolic regulation mechanisms of guanylate kinase.

Key words: arabidopsis thaliana; Guanosine monophosphate kinase; Prokaryotic expression; Carrier to build

目 录

1前言 1

1.1 鸟苷酸激酶生物学意义 1

1.2鸟苷酸酶活测定方法 1

1.3鸟苷酸激酶研究进展 2

2 试验材料、仪器和试验方法 4

2.1材料 4

2.1.1突变型和野生型拟南芥 4

2.1.2仪器 5

2.2 试验方法 5

2.2.1引物设计 5

2.2.2 提取总RNA 6

2.2.3 反转录形成cDNA 7

2.2.4 PCR扩增cDNA序列 7

2.2.5 TA克隆测序 8

2.2.6构建原核表达载体 8

2.2.7诱导蛋白表达 10

2.2.8PAGE分析表达 10

2.2.9纯化表达蛋白 10

2.2.10酶活测定 11

3 结果与分析 12

3.1 拟南芥总RNA提取 12

3.2 mAtGK1编码区序列的克隆 13

3.3 原核表达载体构建 14

3.3.1 构建设计 14

3.3.2 原核表达载体验证 14

讨论 17

致谢 18

参考文献 19

1前 言

1.1 鸟苷酸激酶生物学意义

我们在课题前期工作中发现本课题前期工作中发现模式植物拟南芥中一个GK基因突变后，植株胚珠发育异常，导致植株雌性不育。拟南芥突变体叶子卷曲，果荚萎缩，种子很少或者没有。这个发现给园艺观赏方面提供了新的思路和方向，如果能有拟南芥突变体推广到一般的植物体上，从而使直叶观叶植物变为卷叶观叶植物，观果植物变为观花植物，增加了景物观赏的多样性，也能更进一步的为林业工作研究提供契机和思路。我们经过研究发现导致拟南芥突变，植株发育异常的根源在于植物体内的一个基因，即鸟苷酸激酶（GK）。据研究表明鸟苷酸激酶一般参与生物配子体的发育，核苷酸的代谢过程，以及磷酸化、生长发育的调控。它位于细胞质中，它的分子功能包括ATP结合以及鸟苷酸激酶活性。原核生物、低等真核生物和节枝动物中，GKs非常保守，突变致死。关于GKs在高等生物中的功能目前还知之甚少。鸟苷酸以及鸟苷酸的衍生物都是细胞内核酸合成的底物，并且还是很重要的信号分子。鸟苷酸（GMP）在鸟苷酸激酶（GKs）和核苷二磷酸激酶 （NDK）催化作用下，分别产生二磷酸鸟苷（GDP）和三磷酸鸟苷（GTP），GTP在鸟苷酸环化酶（GC）催化作用下，会生成胞内重要的信号分子环化鸟苷酸（cGMP）。GKs直接影响GDP/GMP胞内比例，进而影响cGMP的产生。

为了更进一步了解给基因的功能，挖掘该激酶特征，本课题准备进行鸟苷酸激酶突变株AtGK1原核表达载体构建，通过诱导表达该激酶，利用融合标签纯化目标蛋白，测定酶活。进行突变株与野生型激酶酶活比较。解析高等植物鸟苷酸激酶体外催化活性对探究鸟苷酸激酶在体内代谢调控机制具有重要的理论意义。

1.2鸟苷酸酶活测定方法

本课题涉及到突变株与野生型激酶酶活比较，因此对酶活测定方法简单介绍一下，便于我们选择合适的酶活测定方法。

我们研究中用酶活力来描述酶催化某一化学反应的能力，而酶活力大小则能用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示，两者之间是线性关系。即酶反应速率越大的话，酶活力越高，反之则越低。而酶催化的反应速率可以用单位时间内底物的减少量或者产物的增加量来表示。