摘 要

鸟苷酸及其代谢衍生物是胞内核酸合成的底物，也是重要的信号分子。鸟苷酸（GMP）通过鸟苷酸激酶（GKs）和核苷二磷酸激酶 （NDK）催化，分别产生二磷酸鸟苷（GDP）和三磷酸鸟苷（GTP），GTP在鸟苷酸环化酶（GC）催化下，生成胞内重要的信号分子环化鸟苷酸（cGMP）。GKs直接影响GDP/GMP胞内比例，进而影响cGMP的产生。在原核生物、低等真核生物和节枝动物中，GKs非常保守，突变致死。关于GKs在高等生物中的功能目前还知之甚少。为了更进一步了解给基因的功能，挖掘该激酶特征，本课题以拟南芥材料为起始材料，提取植株总RNA，反转录后进行RT-PCR,克隆该基因cDNA序列，以pGEX-4T-1为原核表达载体框架，构建原核表达载体（pGEX-4T-1：：cAtGK1，解析高等植物鸟苷酸激酶体外催化活性对探究鸟苷酸激酶在体内代谢调控机制具有重要的理论意义。

关键字：拟南芥；鸟苷酸激酶；原核表达；载体构建

Prokaryotic expression vector construction of Kinase AtGK1 guanylic acid

Abstract

Guanylic acid and its metabolites are not only the substrate of intracellular nucleic acid synthesis metabolism but also important signal molecules^[1]. Guanosine monophosphate (GMP) is catalyzed by guanylate kinase (GSk) and nucleoside diphosphate kinase (NDK) and then respectively diphosphates guanosine (GDP) and guanosine triphosphate (GTP)^[2]. GTP is catalyzed by guanylate cyclase (GC) and generates important intracellular signaling molecules which are called cyclic guanosine monophosphate (cGMP)^[3]. GKs directly affect GDP/GMP intracellular ratio, which affect the generation of cGMP. GKs is very conservative and its mutation is lethal in prokaryotes, lower eukaryotes and arthropods^[4]. GKs`s function in higher organisms is still poorly understood, we should further understand the function of the gene and excavate the kinase’s feature. In this study the starting material was Arabidopsis material, total RNA was extracted from plants and RT-PCR was performed after reverse transcription, The cDNA sequence of gene was cloned, then the prokaryotic expression vector (pGEX-4T-1 :: mAtGK1) was constructed ^[5], its frame is pGEX-4T-1 prokaryotic expression vector frame, parsing in vitro catalytic activity of guanylate kinase of higher plants has important theoretical significance to explore in vivo metabolic regulation mechanisms of guanylate kinase.

Key words: Arabidopsis thaliana; Guanosine monophosphate kinase; Prokaryotic expression; Carrier to build

目 录

1 鸟苷酸激酶 - 5 -

1.1鸟苷酸激酶结构特点 - 5 -

1.1.1PDZ结构域 - 5 -

1.1.2 SH3结构域与GK结构域 - 5 -

1.1.3 MAGUKs蛋白质家族成员 - 5 -

1.2 鸟苷酸激酶的应用 - 5 -

2 实验材料和器材 - 6 -

2.1实验材料 - 6 -

2.2 实验器材 - 7 -

3 实验步骤 - 7 -

3.1 引物设计 - 7 -

3.1.1 引物设计原理 - 7 -

3.1.2 引物设计原则 - 7 -

3.2 提取总RNA - 8 -

3.3 反转录形成CDNA - 9 -

3.4 RT-PCR扩增形成CDNA序列 - 10 -

3.5 TA克隆测序 - 10 -

3.6 构建原核表达载体 - 11 -

3.7 诱导蛋白表达 - 12 -

3.8 纯化表达蛋白 - 12 -

3.9 酶活测定 - 13 -

4 结果与分析 - 14 -

4.1 拟南芥总RNA提取 ...............................................- 14 -

4.2 反转录PCR（RT-PCR） ............................................ .- 15 -

4.3双元表达载体酶切鉴定 .............................................- 16 -

4.4讨论..............................................................- 17 -

致 谢 - 18 -

参考文献 - 19 -

1.鸟苷酸激酶

1.1 鸟苷酸激酶结构特点

膜结合鸟苷酸激酶蛋白质家族成员位于细胞表面，结构保守，含有多个蛋白结合位点。包括三个结构域。这三个结构域有不同的结合特异性，而且其蛋白分子内部可以多聚化后再与其他分子作用，呈现繁多的种属和组织亲和特异性。^[11]

• • 1. PDZ结构域

PDZ结构域多位于细胞连接处，是MAGUKs中最具特色的结构域，PDZ源于三个蛋白质的首字母，分别为哺乳动物突触后密度蛋白PSD-95，果蝇肿瘤抑制蛋白DLG，哺乳动物紧密连接蛋白ZOs，所以也称PDZ域为Dlg类似物区域，也称GLGF重复序列。PDZ有90个氨基酸残基，与一特定短肽序列达10-100nmol亲和力。PDZ域的功能主要通过结合蛋白来实现。

• • 1. SH3结构域与GK结构域

GK和SH3域比邻共存是MAGUKs蛋白的结构特点之一。SH3是由55-70个氨基酸组成的蛋白质域，无代谢活性，介导特定蛋白之间的作用。GK域是鸟苷酸激酶类似物，本身无酶活性。已在酵母中确认负责与核苷酸结合有催化作用的GK域氨基酸序列，该序列在MAGUKs蛋白质家族中有分化保守作用。SH3，GK域也是通过其结合蛋白质来体现自身生物活性，GK域结合蛋白多位于神经系统中。GK和SH3结构域不仅介导MAGUKs蛋白与其他蛋白相作用，尤为重要的是这两个结构域植检也可在分子间和分子内结合。

• • 1. MAGUKs蛋白质家族成员

MAGUKs蛋白质家族成员繁多复杂，目前研究较多是DLG蛋白及其类似物。果蝇DLG多位于突触和表皮细胞隔壁连接，它与细胞分化有关，控制细胞增生，维持细胞极性，诱导果蝇成神经细胞不均等分裂产生顶端成神经细胞和基底神经节母细胞。hDlg/SAP97，人Dlg的类似物。NE-Dlg/SAP102由DLG3基因域编码，倾向于在分化和非增生细胞中表达，而在增生细胞中，则转录后表达下调。其他MAGUKs成员有MAGI-1，Harmonin蛋白，ZO-1，ZO-2，ZO-3等。